2023, Vol. 52文章信息
- 闫丽, 王恺悦, 王喜良, 于月新
- YAN Li, WANG Kaiyue, WANG Xiliang, YU Yuexin
- 戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片对卵巢早衰小鼠激素水平和肠道菌群的调节作用
- Regulatory effects of estradiol valerate tablets/estradiol-cyproterone tablets on hormone levels and intestinal flora in mice with premature ovarian failure
- 中国医科大学学报, 2023, 52(10): 898-903
- Journal of China Medical University, 2023, 52(10): 898-903
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文章历史
- 收稿日期：2023-03-25
- 网络出版时间：2023-10-16 18:18:50
引用本文 |
卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40岁前出现卵巢功能减退，出现闭经、促性腺激素过高和雌激素缺乏现象，是一种常见的妇科内分泌疾病，严重影响患者身体健康[1]。POF的诱发因素主要有遗传、免疫、医源性、环境、心理等因素[2]。目前，激素替代疗法是治疗POF的最常用方法，通过服用激素模拟人体激素分泌，可以改善POF症状[3]。近年来研究[4]发现，肠道菌群与多种疾病密切相关，如精神分裂症、帕金森病、肥胖和代谢性疾病等。其中，肠道菌群与生殖系统疾病的发生、发展关系密切。动物研究[5]结果显示，高脂饲料喂养的成年雄性小鼠中，肠道菌群影响精液微生物群的产生，进而影响精液的质量。在多囊卵巢综合征患者中，肠道菌群组成紊乱，药物治疗后肠道菌群的多样性和丰度明显改善[6]。但是，肠道菌群与POF的相关性尚未见研究报道。
本课题组前期研究建立了POF小鼠模型，并分析了其肠道菌群的变化，结果显示，POF小鼠肠道菌群组成的多样性及个别种属菌群的丰度发生显著改变。为进一步探究肠道菌群与POF的相关性，本研究采用最常用的激素替代疗法（戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片）对POF小鼠模型进行干预，分析肠道差异菌群，探究此治疗方案对肠道菌群紊乱的回调作用，旨在从肠道微生态层面探究戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片的作用机制，为临床探讨POF的发病机制和药物治疗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物SPF级雌性C57BL/6小鼠24只，8周龄，由辽宁长生生物公司提供[SCXK（辽）2020-0001]。保持室温在20~24 ℃，饲养于北部战区总医院实验动物部[SYXK（辽）2018-0021]，给予全价营养饲料，自由饮水和进食。
1.1.2 主要试剂和设备戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片（拜耳医药保健有限公司广州分公司），环磷酰胺（德国Baxter Oncology GmbH公司），水合氯醛（北纳生物有限公司），雌二醇酶联免疫检测试剂盒、促卵泡生成素酶联免疫检测试剂盒（上海江莱生物），BY-600A型离心机（北京白洋医疗器械有限公司），BX51显微镜（日本Olympus公司）。
1.2 方法 1.2.1 POF小鼠模型的建立和分组将C57BL/6雌鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组8只。对照组不作任何处理。模型组和治疗组建立POF模型，小鼠腹腔注射环磷酰胺（50 mg·kg-1·d-1），连续注射15 d。卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）升高，雌二醇（estradiol，E2）水平降低，各级卵泡显著减少，表明POF模型构建成功。造模结束7 d后，治疗组小鼠给予戊醇雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片灌胃处理，5 d为1个周期，共3个周期。将戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片溶于ddH2O，灌胃第1~2天，给予戊酸雌二醇0.13 mg·kg-1·d-1，第3~4天，给予戊酸雌二醇0.13 mg·kg-1·d-1，雌二醇环丙孕酮0.065 mg·kg-1·d-1，第5天不做处理。
1.2.2 小鼠一般状况观察造模和治疗过程中，观察小鼠精神状态、活动情况、毛发光泽度和进食情况，记录体质量变化。
1.2.3 动物取材和处理小鼠10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉，摘眼球采血。小鼠处死后，取双侧卵巢置于中性福尔马林中固定。取小鼠结肠端粪便，保存于无菌冻存管，-80 ℃保存。
1.2.4 血清激素水平检测采用ELISA法检测血清FSH、E2的水平，按照试剂盒说明书操作。
1.2.5 卵巢形态学观察小鼠卵巢经固定后进行石蜡包埋，切成5 μm的切片，HE染色后观察卵巢形态，统计各级卵泡数量。
1.2.6 肠道菌群多样性分析每组随机选取5个粪便样本送至上海伟寰生物公司进行肠道菌群多样性检测。提取样本总DNA，对细菌16S rRNA基因的V3~V4可变区进行PCR扩增。引物序列：341F，5’-ATGCGTAGCCGACCTGAGA-3’；805R，5’-CGTCAGACTTTCGTCCATTGC-3’。构建Miseq文库，应用Illumina NovaSeq PE250平台进行高通量测序，得到序列信息，处理后形成扩增子序列变异（amplicon sequence variant，ASV），对其进行聚类、注释和一系列综合性分析，其中厚壁菌门与拟杆菌门的相对丰度含量比值（F/B）是一个能反映机体健康或炎症状态的指标，F/B越低，机体越健康，F/B越高，炎症反应越严重。
1.2.6.1 α多样性分析使用Shannon指数反映样本的微生物α多样性。Shannon指数越大，样本中微生物种类越丰富，多样性水平越高。
1.2.6.2 β多样性分析β多样性主要反映组间差异，使用ANOSIM分析检验组间差异是否显著大于组内差异，采用主坐标（principal co-ordinates analysis，PCoA）分析、非度量多维尺度法（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析反映微生物群落的相似性。每个点代表 1个样本，相同颜色为1组，点之间的距离越近，相似度越高。
1.3 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料用x±s表示，采用t检验进行比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 小鼠一般情况比较对照组小鼠精神状态好，毛发光滑，反应灵敏。模型组小鼠精神萎靡，活动性差，出现一定程度的脱毛，身形消瘦。治疗组小鼠进食量增加，毛发稍有光泽，反应较为敏捷，体质量较模型组增加。
2.2 小鼠体质量比较实验前（Day 0），3组小鼠比较，体质量无统计学差异（P > 0.05）。腹腔注射环磷酰胺15 d后（Day 15），与对照组比较，模型组和治疗组小鼠体质量明显降低（P < 0.05）。经戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片灌胃治疗15 d后（Day 37），与对照组比较，模型组小鼠体质量明显降低（P < 0.05）；与模型组比较，治疗组小鼠体质量明显升高（P < 0.05）。见表 1。
| Group | Day 0 | Day 15 | Day 37 |
| Control | 26.37±0.12 | 27.28±0.24 | 28.34±0.13 |
| Model | 26.34±0.09 | 26.51±0.141） | 27.03±0.171） |
| Treatment | 26.28±0.17 | 26.47±0.111） | 27.56±0.182） |
| 1）P < 0.05 vs control group；2）P < 0.05 vs model group. | |||
2.3 小鼠血清激素水平比较
与对照组比较，模型组FSH水平明显升高，E2水平明显降低（P < 0.05）；与模型组比较，治疗组FSH水平明显降低，E2水平明显升高（P < 0.05）。见表 2。
| Item | Control | Model | Treatment |
| Serum hormone | |||
| FSH（mU/mL） | 6.89±0.22 | 11.98±0.761） | 9.75±0.742） |
| E2（pg/mL） | 72.23±3.87 | 45.37±3.571） | 56.43±1.982） |
| Follicle number | |||
| Developing follicles | 19.60±3.04 | 13.60±1.521） | 17.40±1.522） |
| Mature follicles | 2.40±1.14 | 1.80±0.841） | 1.80±0.84 |
| Atretic follicle | 3.80±1.30 | 8.20±1.921） | 4.60±0.892） |
| 1）P < 0.05 vs control group；2）P < 0.05 vs model group. | |||
2.4 小鼠卵巢卵泡数量比较
与对照组比较，模型组小鼠卵巢发育卵泡、成熟卵泡明显减少，闭锁卵泡明显增加（P < 0.05）；与模型组比较，治疗组发育卵泡明显增加，闭锁卵泡明显减少（P < 0.05），成熟卵泡数量无明显变化（P > 0.05）。见表 2。
2.5 各组小鼠肠道菌群多样性比较 2.5.1 肠道菌群测序分析对每组小鼠的5个粪便样本进行16S rRNA测序，得到ASV信息。共获得1 040个ASV，其中对照组555个，特有的ASV 212个；模型组455个，特有的ASV 181个；治疗组611个，特有的ASV 240个。3组共有的ASV 176个。见图 1。
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| 图 1 小鼠肠道菌群ASV韦恩图 Fig.1 Venn diagram of ASV of the intestinal flora in mice |
2.5.2 α多样性分析
本研究中，各样本的Goods-coverage指数接近于1，表明测序深度已基本覆盖到样本所有的物种（图 2A）。随着样本序列数的增加，曲线逐渐趋于平坦，表明测序数据量足够反映样本中绝大部分的序列信息，结果可信度高（图 2B）。对照组、模型组、治疗组的Shannon指数分别为4.60±0.232、5.60±0.426、5.78±0.381。结果表明，与对照组比较，模型组和治疗组小鼠肠道中微生物种类多样性增加（P < 0.05）。
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| A, Goods-coverage index; B, Shannon exponential curve. 图 2 小鼠肠道菌群的α多样性分析 Fig.2 α diversity analysis of intestinal flora in mice |
2.5.3 β多样性分析
ANOSIM分析结果为R = 0.671，P = 0.001，表明3组间物种丰富度有显著差异（图 3A）。肠道菌群PCoA分析和NMDS分析反映组间微生物群落的差异程度。结果显示，对照组与模型组菌群明显分开，表明2组菌群结构有显著差异；治疗组位于2组之间，表明戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片灌胃治疗对小鼠肠道菌群结构差异有回调作用（图 3B、3C、3D）。
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| A, ANOSIM analysis; B, PCoA analysis; C and D, NMDS analysis. 图 3 小鼠肠道菌群的β多样性分析 Fig.3 β diversity analysis of intestinal flora in mice |
2.5.4 物种组成丰度分析
采用柱形累加图（图 4）表示3组小鼠粪便中的肠道菌群在不同分类水平上物种的相对丰度。与对照组比较，模型组F/B明显升高，Muribaculaceae丰度明显降低，Lachnospiraceae、Alistipes丰度明显升高（均P < 0.05）；与模型组比较，治疗组F/B明显降低，Muribaculaceae丰度明显升高，Lachnospiraceae、Alistipes丰度明显降低（均P < 0.05）。见表 3。
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| A, door level; B, genus level; C, species level. 图 4 小鼠肠道菌群的相对丰度 Fig.4 Relative abundance of intestinal flora in mice |
| Group | F/B | Muribaculaceae | Lachnospiraceae | Alistipes |
| Control | 0.417 | 38.17±4.26 | 2.63±0.87 | 1.81±0.43 |
| Model | 2.772 | 15.20±1.571） | 5.72±1.301） | 4.46±0.621） |
| Treatment | 1.832 | 24.97±2.582） | 3.16±0.672） | 2.94±0.912） |
| 1）P < 0.05 vs control group；2）P < 0.05 vs model group. | ||||
3 讨论
肠道菌群与人类健康密切相关，是肠道的重要组成部分，在多种疾病的发生、发展中扮演重要角色，或可作为综合防治策略之一。本研究建立环磷酰胺诱导的POF模型，并给予戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片治疗，探究其对小鼠激素水平和肠道菌群的调节作用，通过分析肠道菌群的变化，从肠道菌群的角度为治疗POF提供科学依据。
卵巢内分泌水平能够间接反映卵巢功能。通过下丘脑-垂体-性腺轴调控各种激素的分泌，下丘脑通过分泌促性腺激素释放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）作用于垂体；垂体释放FSH，正反馈作用于卵巢，刺激分泌E2；E2过高时会通过负反馈调节GnRH和FSH的水平，维持机体激素的动态平衡[7]。E2和FSH可作为评价卵巢功能的重要指标。E2是成熟卵泡分泌的一种雌激素，能够促进颗粒细胞增殖、分化，调控颗粒细胞的凋亡，调节类固醇激素水平。FSH主要起到促进卵泡颗粒细胞分化成熟、控制卵泡发育的作用，FSH激素水平较高时，会造成卵泡早熟和提前排出，导致卵泡衰竭。当E2分泌水平过低且FSH分泌水平过高时，可初步评估卵巢的储备功能，对判断POF有重要作用[8]。本研究中，与对照组比较，模型组小鼠血清E2水平显著降低，FSH水平显著升高，体质量降低，卵巢中发育卵泡、成熟卵泡减少，闭锁卵泡增加，表明环磷酰胺会对下丘脑-垂体-性腺轴产生干扰，影响小鼠生长和发育，降低卵巢储备功能。与模型组比较，治疗组E2水平显著升高，FSH水平显著降低，体质量增加，发育卵泡增加，闭锁卵泡减少，表明戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片能够改善小鼠的激素紊乱和卵巢功能衰退。
血液中激素水平也与肠道菌群有关，菌群组成紊乱影响小鼠的肠肝循环，使代谢产物β-葡萄糖醛酸酶影响结合雌激素与游离雌激素二者的转换过程，从而影响血清中雌激素的水平[9]。肠道菌群一般处于动态平衡中，与宿主相互作用，通过调节糖、脂质和氨基酸等物质的代谢，影响疾病的发生、发展，菌群失调将会导致相关疾病的发生，如肠炎、阿尔茨海默病、肥胖等[10-11]。本研究采用16S rRNA测序技术分析小鼠肠道菌群的变化，与模型组相比，治疗组F/B降低，表明小鼠肠道炎症反应有所缓解。与模型组比较，治疗组优势菌群Muribaculaceae的丰度恢复。Muribaculaceae作为有益菌，与纤维降解有关，可产生琥珀酸、乙酸和丙酸，与维持肠道稳态和改善炎症性疾病有关[12]。与模型组比较，治疗组Lachnospiraceae的丰度降低。Lachnospiraceae与代谢紊乱、糖尿病的发生有关，其丰度与葡萄糖或脂代谢呈正相关，丰度越高，炎症反应越严重[13]。以上结果表明，戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片能够改善POF小鼠肠道的炎症反应，在维持肠道稳态上发挥重要作用。与模型组比较，治疗组Alistipes丰度降低。在致病性方面，Alistipes与抑郁症、焦虑症、结肠癌有关，Alistipes的增加可能通过破坏肠-脑轴来减少血清素的可利用性，引发抑郁症[14]。本研究中，模型组小鼠精神萎靡可能与该菌群丰度增加有关。
综上所述，本研究结果表明，戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片能够缓解小鼠的激素紊乱和卵巢功能衰退，减轻POF小鼠的肠道炎症反应，改变肠道黏膜的通透性，增加有益菌Muribaculaceae的丰度，减少有害菌Lachnospiraceae、Alistipes的定植，对小鼠肠道菌群紊乱有一定的改善作用。本研究从肠道微生态层面上探究了戊酸雌二醇片/雌二醇环丙孕酮片治疗POF的作用机制，为临床探讨POF的发病机制和药物治疗提供了理论依据。
| [1] |
RAHMAN R, PANAY N. Diagnosis and management of premature ovarian insufficiency[J]. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 2021, 35(6): 101600. DOI:10.1016/j.beem.2021.101600 |
| [2] |
CHON SJ, UMAIR Z, YOON MS. Premature ovarian insufficiency: past, present, and future[J]. Front Cell Dev Biol, 2021, 9: 672890. DOI:10.3389/fcell.2021.672890 |
| [3] |
中华医学会妇产科学分会绝经学组. 早发性卵巢功能不全的激素补充治疗专家共识[J]. 中华妇产科杂志, 2016, 51(12): 881-886. DOI:10.3760/cma.j.issn.0529-567x.2016.12.001 |
| [4] |
ZHOU B, YUAN Y, ZHANG S, et al. Intestinal flora and disease mutually shape the regional immune system in the intestinal tract[J]. Front Immunol, 2020, 11: 575. DOI:10.3389/fimmu.2020.00575 |
| [5] |
JAVUREK AB, SPOLLEN WG, JOHNSON SA, et al. Consumption of a high-fat diet alters the seminal fluid and gut microbiomes in male mice[J]. Reprod Fertil Dev, 2017, 29(8): 1602-1612. DOI:10.1071/RD16119 |
| [6] |
ZHANG F, MA T, CUI P, et al. Diversity of the gut microbiota in dihydrotestosterone-induced PCOS rats and the pharmacologic effects of Diane-35, probiotics, and berberine[J]. Front Microbiol, 2019, 10: 175. DOI:10.3389/fmicb.2019.00175 |
| [7] |
朱景茹, 陈姝婷, 卓泽伟, 等. 补肾健脾方对卵巢早衰大鼠下丘脑-垂体-性腺轴功能的影响[J]. 福建中医药, 2021, 52(2): 14-17. DOI:10.3969/j.issn.1000-338X.2021.02.005 |
| [8] |
BROWN C, LAROCCA J, PIETRUSKA J, et al. Subfertility caused by altered follicular development and oocyte growth in female mice lacking PKB alpha/Akt1[J]. Biol Reprod, 2010, 82(2): 246-256. DOI:10.1095/biolreprod.109.077925 |
| [9] |
NOGUERA-JULIAN M, ROCAFORT M, GUILLÉN Y, et al. Gut microbiota linked to sexual preference and HIV infection[J]. EBioMedicine, 2016, 5: 135-146. DOI:10.1016/j.ebiom.2016.01.032 |
| [10] |
PARIDA S, SHARMA D. The microbiome-estrogen connection and breast cancer risk[J]. Cells, 2019, 8(12): 1642. DOI:10.3390/cells8121642 |
| [11] |
ERVIN SM, LI H, LIM L, et al. Gut microbial β-glucuronidases reactivate estrogens as components of the estrobolome that reactivate estrogens[J]. J Biol Chem, 2019, 294(49): 18586-18599. DOI:10.1074/jbc.RA119.010950 |
| [12] |
PARKER BJ, WEARSCH PA, VELOO ACM, et al. The genus Alistipes: gut bacteria with emerging implications to inflammation, cancer, and mental health[J]. Front Immunol, 2020, 11: 906. DOI:10.3389/fimmu.2020.00906 |
| [13] |
CHEN YJ, WU H, WU SD, et al. Parasutterella, in association with irritable bowel syndrome and intestinal chronic inflammation[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2018, 33(11): 1844-1852. DOI:10.1111/jgh.14281 |
| [14] |
VACCA M, CELANO G, CALABRESE FM, et al. The controversial role of human gut Lachnospiraceae[J]. Microorganisms, 2020, 8(4): 573. DOI:10.3390/microorganisms8040573 |