2023, Vol. 52
STEAP3在脑缺血再灌注损伤沙鼠中的表达及意义
文章信息
- 李晓蕾, 李忠华, 王鹏
- LI Xiaolei, LI Zhonghua, WANG Peng
- STEAP3在脑缺血再灌注损伤沙鼠中的表达及意义
- Expression of STEAP3 and its significance in gerbils with cerebral ischemia-reperfusion injury
- 中国医科大学学报, 2023, 52(1): 57-61, 67
- Journal of China Medical University, 2023, 52(1): 57-61, 67
-
文章历史
- 收稿日期：2022-06-20
- 网络出版时间：2023-01-18 08:36:21
引用本文 |
李晓蕾, 李忠华, 王鹏.
STEAP3在脑缺血再灌注损伤沙鼠中的表达及意义[J]. 中国医科大学学报, 2023, 52(1): 57-61, 67.
LI Xiaolei, LI Zhonghua, WANG Peng. Expression of STEAP3 and its significance in gerbils with cerebral ischemia-reperfusion injury[J]. Journal of China Medical University, 2023, 52(1): 57-61, 67.
STEAP3在脑缺血再灌注损伤沙鼠中的表达及意义
1. 贵州医科大学第三附属医院实验中心, 贵州 都匀 558000;
2. 贵州医科大学第三附属医院神经外科, 贵州 都匀 558000;
3. 哈尔滨医科大学大庆校区基础医学院生理学教研室, 哈尔滨 大庆 163319
2. 贵州医科大学第三附属医院神经外科, 贵州 都匀 558000;
3. 哈尔滨医科大学大庆校区基础医学院生理学教研室, 哈尔滨 大庆 163319
摘要：目的 探讨前列腺六跨膜上皮抗原3（STEAP3）在脑缺血再灌注（I/R）损伤沙鼠中的表达及意义。方法 将48只沙鼠随机分为假手术组（Sham组）、I/R模型组（I/R组）、I/R模型+STEAP3 siRNA组（siRNA组）和I/R模型+scramble siRNA组（Control组），每组12只。进行沙鼠神经功能评分。Nissl染色观察海马CA1区神经元。Fe2+试剂盒检测海马组织Fe2+水平。Western blotting检测海马组织中STEAP3、H2AX、4-HNE、GPX4蛋白的表达。应用丙二醛（MDA）试剂盒检测海马组织中MDA含量。结果 I/R组沙鼠神经功能学评分、STEAP3、H2AX、4-HNE蛋白及MDA和Fe2+水平明显高于Sham组（P < 0.05），而神经元数量和GPX4蛋白表达明显低于Sham组（P < 0.01）；与I/R组比较，siRNA组沙鼠神经功能学评分、STEAP3、H2AX、4-HNE蛋白及MDA和Fe2+水平明显降低（P < 0.05），神经元数量和GPX4蛋白表达明显增多（P < 0.05）。结论 STEAP3在沙鼠脑I/R损伤中高表达，通过介导铁死亡影响脑I/R损伤的发生和发展，抑制其表达对脑I/R损伤具有保护作用。
Expression of STEAP3 and its significance in gerbils with cerebral ischemia-reperfusion injury
1. Department of Medical Experimental Center, The Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Duyun 558000, China;
2. Department of Neurosurgery, The Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Duyun 558000, China;
3. Department of Physiology, College of Basic Medical Science, Harbin Medical University (Daqing), Daqing 163319, China
2. Department of Neurosurgery, The Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Duyun 558000, China;
3. Department of Physiology, College of Basic Medical Science, Harbin Medical University (Daqing), Daqing 163319, China
Abstract: Objective To explore the expression of six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3 (STEAP3) and its significance in gerbils with cerebral ischemia-reperfusion (I/R) injury. Methods Forty-eight gerbils were randomly divided into four groups: a sham group, an I/R model group (I/R group), an I/R model+STEAP3 siRNA group (siRNA group), and an I/R model+scramble siRNA group (control group), with n=12 per group. Neurological function was scored. Nissl staining was performed to observe the neurons in the hippocampus. The expression of STEAP3, H2AX, 4-HNE, and GPX4 in the hippocampus was measured using Western blotting. The levels of malondialdehyde (MDA) and Fe2+ were assessed. Results The neurological function scores, the expression of STEAP3, H2AX, and 4-HNE, and the levels of MDA and Fe2+ were significantly higher in the I/R group (P < 0.05) than in the sham group, and the expression of GPX4 and the number of normal neurons were significantly lower (P < 0.01). The neurobehavioral scores, the expression of STEAP3, H2AX, and 4-HNE, and the levels of MDA and Fe2+ were significantly lower in the siRNA group (P < 0.05) than in the I/R group, and the expression of GPX4 and the number of normal neurons were significantly higher (P < 0.05). Conclusion Increased expression of STEAP3 was found in gerbils with cerebral I/R injury, which may affect the occurrence and development of cerebral I/R injury by mediating ferroptosis. Knockout of STEAP3 can protect the brain from I/R injury.
脑缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤是缺血性脑卒中后一定时间内恢复或重建血液再灌注，使原有的缺血性损伤进一步加重的现象，与缺血性脑卒中后的致残率和死亡率密切相关[1]。脑I/R损伤可发生于缺血后数小时至数天，最终导致神经元损伤，与氧化应激、炎症反应等相关[2]。进一步明确脑I/R损伤的发生机制，制定有效的防治措施，是脑卒中研究有待解决的重要问题。铁离子广泛存在于脑组织中，脑缺血时脑组织中铁离子含量增加，神经元脂质过氧化，细胞死亡增多。研究[3]表明，铁代谢和脂质代谢调控信号异常均能导致铁死亡的发生，说明铁死亡在脑I/R损伤中发挥关键作用。前列腺六跨膜上皮抗原3（six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3，STEAP3）属于STEAP家族，是一种铁还原酶，在铁代谢过程中能够促进Fe3+还原成Fe2+，影响铁稳态、炎症、细胞增殖等过程[4]。研究[5]发现，敲除STEAP3表达通过抑制TAK1途径而减轻肝脏I/R损伤。然而，STEAP3在脑I/R损伤中的表达及其与铁死亡是否有关未见报道。本研究基于铁死亡，分析STEAP3在沙鼠脑I/R损伤中的表达及意义。
1 材料与方法 1.1 实验动物和分组48只健康雄性蒙古沙鼠，体质量60~80 g，4~5月龄，由哈尔滨医科大学大庆校区机能实验室提供。动物饲养实验室温度（24±1）℃，湿度45%~70%。将48只沙鼠随机分为假手术组（Sham组）、I/R模型组（I/R组）、I/R模型+STEAP3小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）组（siRNA组）和I/R模型+scramble siRNA组（Control组），每组12只。
1.2 主要试剂STEAP3和4-HNE购自英国Abcam公司；H2AX购自美国Cell signaling公司；谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）购自美国Santa Cruz公司；GAPDH购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Nissl、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和Fe2+试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术公司。STEAP3 siRNA和scramble siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司，X-treme GENE siRNA转染试剂购自美国罗氏公司。
1.3 沙鼠脑I/R损伤模型的建立沙鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉。麻醉后仰卧位固定，剪去颈部的毛，再剪开皮肤，分离皮下组织和肌肉，显示出两侧颈总动脉，使用无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5 min。松开动脉夹，使脑血流恢复。Sham组不夹闭两侧颈总动脉，其他操作同I/R组。siRNA组和Control组沙鼠在手术前24 h分别尾静脉注射STEAP3 siRNA和scramble siRNA，其他操作同I/R组。
1.4 神经功能评分建模后24 h，参考文献[6]进行神经功能评分：无症状，0分；身体蜷缩或毛发凌乱，1分；眼睑下垂，2分；旋转行为，3分；后肢外翻，4分；痉挛，5分。分值越高，说明沙鼠神经功能损伤情况越严重。
1.5 Nissl染色沙鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉，断头取脑，分离海马组织，用于后续实验。每组随机选取6只沙鼠的海马组织，制成石蜡切片。切片脱蜡至水后，滴加Nissl染色液，37 ℃孵育10 min，蒸馏水洗3次，梯度乙醇脱水，二甲苯透明2次，10 min/次，中性树脂胶封片。
1.6 Fe2+和MDA水平测定每组随机选取6只沙鼠海马组织，称重后用生理盐水制成10%的匀浆，离心后取上清。根据试剂盒说明书检测Fe2+和MDA水平。
1.7 Western blotting检测STEAP3、H2AX、4-HNE、GPX4蛋白的表达收集沙鼠的海马组织，提取总蛋白，测定浓度。经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭后，分别用STEAP3（1∶100）、H2AX（1∶100）、4-HNE（1∶200）、GPX4（1∶500）抗体4 ℃孵育过夜，洗膜后二抗室温孵育，ECL显色成像。通过图像分析软件进行积分吸光度分析。
1.8 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行数据统计。结果以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 STEAP3在脑I/R沙鼠海马组织中的表达采用Western blotting检测Sham组和I/R组沙鼠海马组织中STEAP3蛋白的表达。结果显示，I/R组STEAP3蛋白的表达高于Sham组（P < 0.05），见图 1。提示STEAP3蛋白高表达可能与脑I/R损伤相关。
|
| 图 1 Western blotting检测STEAP3蛋白的表达 Fig.1 Expression of STEAP3 protein detected using Western blotting |
2.2 STEAP3干扰后对脑I/R沙鼠神经功能评分的影响
脑I/R后24 h进行神经功能评分。Sham组沙鼠无神经功能缺损的症状，神经功能评分为0分；I/R组沙鼠神经功能受到不同程度损伤，出现身体蜷缩、眼睑下垂、旋转行为、后肢外翻及痉挛等，神经功能评分为（3.58±1.24）分；siRNA组沙鼠主要表现为身体蜷缩、毛发凌乱和眼睑下垂等，神经功能评分为（2.58±0.90）分；Control组沙鼠表现与I/R组相同，神经功能评分为（3.50±1.09）分。I/R组神经功能评分明显高于Sham组（P < 0.01），与Control组比较无统计学差异（P > 0.05）；siRNA组神经功能评分低于I/R组（P < 0.01）和Control组（P < 0.05）。
2.3 STEAP3干扰后脑I/R沙鼠海马组织中STEAP3和H2AX的表达Western blotting检测沙鼠海马组织中STEAP3蛋白和细胞DNA损伤指标H2AX蛋白的表达情况。结果显示，I/R组STEAP3蛋白和H2AX蛋白的表达明显高于Sham组（P < 0.05，P < 0.01），siRNA组STEAP3蛋白和H2AX蛋白的表达明显低于I/R组（均P < 0.01）和Control组（P < 0.05，P < 0.01），I/R组与Control组比较差异无统计学意义（均P > 0.05）。见图 2。
|
| A, STEAP3 protein; B, H2AX protein. * P < 0.05 vs Sham group; ** P < 0.01 vs Sham group; ## P < 0.01 vs I/R group; & P < 0.05 vs siRNA group; && P < 0.01 vs siRNA group. 图 2 Western blotting检测STEAP3蛋白和H2AX蛋白的表达水平 Fig.2 Expression of STEAP3 and H2AX proteins detected using Western blotting |
2.4 STEAP3干扰后对脑I/R沙鼠海马神经元损伤的影响
Nissl染色（图 3A）显示各组沙鼠海马组织CA1区神经元损伤情况：Sham组神经元形态结构正常；I/R组和Control组神经元轮廓模糊，部分神经元丢失；siRNA组与I/R组比较，神经元数量增多，结构轮廓比较清晰。显微镜下计数各组海马组织CA1区神经元数量，结果（图 3B）显示，I/R组神经元数量明显低于Sham组（P < 0.01），siRNA组神经元数量明显增多于I/R组和Control组（P < 0.01），Control组与I/R组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
|
| A, Nissl staining of hippocampal CA1 region (×200);B, statistical analysis of the surviving neurons in the hippocampal CA1 region. ** P < 0.01 vs Sham group; ## P < 0.01 vs I/R group; && P < 0.01 vs siRNA group. 图 3 STEAP3对脑I/R沙鼠海马神经元损伤的影响 Fig.3 Effects of STEAP3 on hippocampal neuron injury of gerbils with cerebral I/R |
2.5 STEAP3干扰后对脑I/R沙鼠海马组织中GPX4蛋白表达的影响
GPX4为铁死亡相关蛋白，应用Western blotting检测各组沙鼠海马组织中GPX4的表达情况，结果（图 4）显示，I/R组与Sham组比较GPX4蛋白表达明显减少（P < 0.01），siRNA组GPX4蛋白表达明显高于I/R组（P < 0.05）和Control组（P < 0.01），Control组与I/R组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
|
| ** P < 0.01 vs Sham group; # P < 0.05 vs I/R group; && P < 0.01 vs siRNA group. 图 4 STEAP3对脑I/R沙鼠海马组织中GPX4蛋白表达的影响 Fig.4 Effects of STEAP3 on the expression of GPX4 protein in the hippocampus of gerbils with cerebral I/R |
2.6 STEAP3干扰后对脑I/R沙鼠海马组织中Fe2+的影响
应用Fe2+试剂盒检测沙鼠海马组织中的Fe2+，结果（图 5）显示，I/R组与Sham组比较Fe2+水平明显升高（P < 0.01），siRNA组Fe2+水平明显下降，明显低于I/R组和Control组（P < 0.01），Control组与I/R组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
|
| ** P < 0.01 vs Sham group; ## P < 0.01 vs I/R group; && P < 0.01 vs siRNA group. 图 5 STEAP3对脑I/R沙鼠海马组织中Fe2+水平的影响 Fig.5 Effects of STEAP3 on the Fe2+ levels in the hippocampus of gerbils with cerebral I/R |
2.7 STEAP3干扰后对脑I/R沙鼠海马组织中4-HNE表达和MDA含量的影响
为了分析STEAP3对细胞脂质氧化的影响，首先应用Western blotting检测4-HNE蛋白的表达，结果（图 6A）显示，I/R组4-HNE蛋白表达明显高于Sham组（P < 0.05），而敲除STEAP3后siRNA组4-HNE蛋白表达低于I/R组和Control组（P < 0.05），Control组与I/R组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。接下来应用MDA试剂盒检测MDA含量，结果（图 6B）显示，I/R组脑组织MDA含量明显高于Sham组（P < 0.01），而siRNA组MDA含量明显低于I/R组和Control组（P < 0.01），Control组与I/R组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
|
| A, 4-HNE protein; B, MDA. *P < 0.05 vs Sham group; **P < 0.01 vs Sham group; # P < 0.05 vs I/R group; ## P < 0.01 vs I/R group; & P < 0.05 vs siRNA group; && P < 0.01 vs siRNA group. 图 6 STEAP3对脑I/R沙鼠海马组织中4-HNE蛋白表达和MDA含量的影响 Fig.6 Effects of STEAP3 on the expression of 4-HNE protein and MDA content in the hippocampus of gerbils with cerebral I/R |
3 讨论
脑是机体重要的器官之一，对缺氧的耐受能力差，缺血数分钟就会造成不可逆性损伤。但在缺血后一定时间内恢复脑血液灌注，会加重缺血脑组织不可逆性损伤[7]。脑缺血再灌注损伤与缺血性脑卒中后的致残率和死亡率密切相关，深入阐明脑I/R损伤的发生机制，能够为临床治疗提供重要参考，减轻再灌注导致的脑组织损伤程度。本研究发现，铁还原酶STEAP3在沙鼠脑I/R模型中高表达，敲除其表达可明显减轻脑组织损伤，说明STEAP3能够促进脑I/R损伤的发生；通过检测铁死亡相关指标GPX4、Fe2+、4-HNE、MDA，发现脑I/R损伤中STEAP3可能通过铁死亡途径发挥作用。
短暂的缺血性低灌注可导致严重的急性脑损伤。脑组织再灌注过程中，多种复杂的机制可诱导神经元死亡，导致迟发性神经损伤。大量研究已经证实，在脑I/R引起的神经元损伤中，铁死亡是神经元死亡的主要形式之一。铁死亡是基于细胞内亚铁的细胞死亡方式，在生物化学、形态和遗传上与凋亡、坏死和自噬不同[8]，铁和氧化还原代谢的多种因素导致了铁死亡。
STEAP家族包括4个多通道膜蛋白，最初被报道为铁稳态调节因子，并已被确定参与许多细胞和分子事件，如细胞命运和炎症反应。STEAP3作为该家族的主要成员之一，已被证实参与了铁稳态、外泌体的组装和分泌、炎症等一些生物学过程[9]。本研究通过Western blotting检测沙鼠海马组织中STEAP3蛋白的表达，发现I/R组STEAP3蛋白的表达明显高于Sham组，提示STEAP3在脑I/R损伤中可能发挥一定的作用。为探究STEAP3的作用机制，造模前24 h给予沙鼠尾静脉注射STEAP3 siRNA（siRNA组）。siRNA组沙鼠神经功能评分和海马组织中DNA损伤指标H2AX蛋白表达明显低于I/R组，Nissl染色也发现siRNA组海马CA1区神经元数量多于I/R组。这些结果说明，敲除STEAP3能够减轻脑I/R组织的损伤程度。
铁死亡的主要特点是铁依赖性，即细胞内游离铁增多，Fe2+提供了氧化过程所需的电子。贮铁蛋白降解释放和转铁蛋白转入增多等多种途径使大量Fe3+进入细胞内，细胞内Fe3+被还原为Fe2+，构成了体内不稳定铁池的来源，一方面通过芬顿反应直接导致脂质过氧化物增多，另一方面参与合成含铁酶类促发铁死亡[10]。STEAP3是一种铁还原酶，能够促进Fe3+还原成Fe2+。本研究证实，I/R组Fe2+增多，干扰STEAP3表达，siRNA组与I/R组比较沙鼠海马组织Fe2+水平明显降低，说明STEAP3能够影响脑I/R组织中Fe2+的水平。
GPX4被认为是铁死亡标志性蛋白，是一种将H2O2分解成水或相应醇的酶，GPX4活性降低可提高细胞质和脂质的活性氧水平，最终导致细胞铁死亡[11]。4-HNE蛋白表达和MDA含量被用来评价细胞内脂质氧化的水平。本研究也进一步证实，与Sham组比较I/R组GPX4蛋白表达减少，4-HNE蛋白表达和MDA含量增多；而siRNA组与I/R组比较，GPX4蛋白表达增多，4-HNE蛋白表达和MDA含量减少。以上结果提示，STEAP3可能通过促进细胞内Fe3+还原为Fe2+，介导铁死亡，从而影响脑I/R损伤的发生和发展。
STEAP3是铁代谢有关的基因，与肿瘤等多种疾病有关。在肿瘤的研究中发现，STEAP3通过诱导间质转化、促进转铁蛋白受体表达和激活STAT3-FoxM1信号轴促进胶质瘤的进展[12]；STEAP3通过阻滞细胞周期G1期，抑制肝癌细胞增殖[13]。在病理性心肌肥大的研究中发现，STEAP3可阻断Rac1依赖性信号级联的激活，是病理性心肌肥大的负调节因子[14]。STEAP3在肝脏I/R损伤中的作用已被证实，并通过TAK1介导JNK/p38途径发挥功能[5]。
综上所述，本研究证实了STEAP3在沙鼠脑I/R损伤中高表达，并通过介导铁死亡而影响脑I/R损伤的发生和发展，抑制其表达对脑I/R损伤具有保护作用。
参考文献
| [1] |
RAMLI F, ALI A, IBRAHIM N. Protective effects of tocotrienols in cerebral and myocardial ischemia-reperfusion injury: a systematic review[J]. Appl Sci, 2021, 11(17): 7994. DOI:10.3390/app11177994 |
| [2] |
YUAN Q, YUAN Y, ZHENG Y, et al. Anti-cerebral ischemia reperfusion injury of polysaccharides: a review of the mechanisms[J]. Biomed Pharmacother, 2021, 137: 111303. DOI:10.1016/j.biopha.2021.111303 |
| [3] |
WEILAND A, WANG Y, WU W, et al. Ferroptosis and its role in diverse brain diseases[J]. Mol Neurobiol, 2019, 56(7): 4880-4893. DOI:10.1007/s12035-018-1403-3 |
| [4] |
WILKINSON HN, UPSON SE, BANYARD KL, et al. Reduced iron in diabetic wounds: an oxidative stress-dependent role for STEAP3 in extracellular matrix deposition and remodeling[J]. J Invest Dermatol, 2019, 139(11): 2368-2377. DOI:10.1016/j.jid.2019.05.014 |
| [5] |
GUO WZ, FANG HB, CAO SL, et al. Six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 3 deficiency in hepatocytes protects the liver against ischemia-reperfusion injury by suppressing transforming growth factor-β-activated kinase 1[J]. Hepatology, 2020, 71(3): 1037-1054. DOI:10.1002/hep.30882 |
| [6] |
MCGRAW CP. Experimental cerebral infarction effects of pentobarbital in Mongolian gerbils[J]. Arch Neurol, 1977, 34(6): 334-336. DOI:10.1001/archneur.1977.00500180028006 |
| [7] |
WU Y, SONG J, WANG Y, et al. The potential role of ferroptosis in neonatal brain injury[J]. Front Neurosci, 2019, 13: 115. DOI:10.3389/fnins.2019.00115 |
| [8] |
OOSTERHEERT W, REIS J, GROS P, et al. An elegant four-helical fold in NOX and STEAP enzymes facilitates electron transport across biomembranes-similar vehicle, different destination[J]. Acc Chem Res, 2020, 53(9): 1969-1980. DOI:10.1021/acs.accounts.0c00400 |
| [9] |
WU HT, CHEN WJ, XU Y, et al. The tumor suppressive roles and prognostic values of STEAP family members in breast cancer[J]. Bio-med Res Int, 2020, 2020: 9578484. DOI:10.1155/2020/9578484 |
| [10] |
胡婉湘, 谢露. 铁死亡及其在脑缺血再灌注损伤中的作用[J]. 生理科学进展, 2021, 52(3): 169-175. DOI:10.3969/j.issn.0559-7765.2021.03.002 |
| [11] |
LEI P, BAI T, SUN Y. Mechanisms of ferroptosis and relations with regulated cell death: a review[J]. Front Physiol, 2019, 10: 139. DOI:10.3389/fphys.2019.00139 |
| [12] |
HAN MZ, XU R, WANG S, et al. Six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3 predicts poor prognosis and promotes glioblastoma growth and invasion[J]. Neoplasia, 2018, 20(6): 543-554. DOI:10.1016/j.neo.2018.04.002 |
| [13] |
范伟明, 姚志成, 徐见亮, 等. STEAP3对肝癌细胞增殖能力的抑制作用及机制[J]. 中华肝脏外科手术学电子杂志, 2017, 6(2): 134-138. DOI:10.3877/cma.j.issn.2095-3232.2017.02.014 |
| [14] |
LI PL, LIU H, CHEN GP, et al. STEAP3(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3) inhibits pathological cardiac hypertrophy[J]. Hypertension, 2020, 76(4): 1219-1230. DOI:10.1161/HYPERTENSIONAHA.120.14752 |