随着细胞生物学和分子生物学研究的不断深入, 肿瘤免疫治疗蓬勃发展, 已经成为多种恶性肿瘤的重要治疗手段。肿瘤免疫治疗主要是通过免疫诱导剂使机体产生肿瘤特异性免疫应答来抑制和杀伤肿瘤细胞, 相较于传统的放化疗, 其优势在于广谱和持久。Toll样受体(toll-like receptor, TLR)在免疫细胞中几乎无处不在, 它们通过识别病原体、介导内源性损伤等方式发挥作用^[1]。迄今为止, 已在人类中鉴定出11种功能不同的TLR, 并将其分为跨膜TLR (TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR11)和细胞内TLR (TLR3、TLR7、TLR8和TLR9)。已有研究^[2]表明, TLR在正常细胞和肿瘤细胞的增殖和凋亡中发挥调节作用, TLR信号传导失调会导致促进肿瘤生长的微环境。前期研究^[3]表明, TLR2在骨关节炎和腰椎间盘退变中发挥重要作用。TLR2可以刺激细胞中趋化因子和危险相关分子的释放, 在肿瘤细胞中表现为促进肿瘤存活和进展。但在肺癌中, TLR2高表达患者预后更好^[4]。研究^[5]发现, TLR2参与乳腺癌的免疫调节。还有研究^[6]证明, TLR2在肝细胞癌中介导更强的细胞毒性和增殖能力。这些研究结果表明TLR2在某些肿瘤的免疫调节中具有重要作用, 但目前尚无研究对泛癌中TLR2的作用机制进行全面研究。

因此, 本研究应用UCSC Xena数据库分析TLR2在肿瘤和正常组织中的差异表达, 明确TLR2是否为泛癌中的重要基因, 应用R语言survival包和survminer包分析TLR2高表达对患者预后的影响, 应用cBio-Portal数据库分析TLR2基因变异情况, 应用TIMER数据库分析TLR2在免疫细胞浸润中的作用, 应用基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)数据库分析TLR2的生物学功能。

1 材料与方法 1.1 TLR2在肿瘤中的表达

从UCSC Xena数据库(https://xenabrowser.net/datapages)下载癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)和基因型组织表达(Genotype-Tissue Expression, GTEx)数据库中的RNA和临床数据。剔除单个癌种中样本数量 < 3的癌种, 应用R语言(v4.0.3)对TLR2的每个表达值进行log2 (x+0.001)变换, 存在多转录本时, 结果取均值, 计算每种肿瘤中TLR2在肿瘤组织和正常组织的表达情况。

1.2 预后分析

分析TCGA数据库中TLR2表达与肿瘤预后的关系。根据每种肿瘤中TLR2表达的中位数, 将样本分为TLR2高表达组和TLR2低表达组。采用R语言survival包和survminer包, 分析TLR2表达水平对不同肿瘤预后的影响。风险比(hazard ratio, HR) > 1, 表明TLR2高表达是泛癌的危险因素; HR < 1, 表明TLR2高表达是泛癌的保护因素。

1.3 遗传和表观遗传改变的分析

在cBioPortal网站(https://www.cbioportal.org/)选择“快速选择”部分的“TCGA泛癌图谱研究”, 输入“TLR2”, 查询TLR2基因变异情况。在“癌症类型小结”模块中可以观察到所有TCGA数据库肿瘤中TLR2的突变频率、突变类型和拷贝数的改变。

1.4 TLR2与免疫学特征的相关性

通过TIMER数据库(http://timer.cistrome.org/)的“免疫基因”模块, 研究所有TCGA肿瘤中TLR2表达与免疫细胞浸润的关系。该数据库利用R语言estimate包, 根据基因表达量计算每种肿瘤中TLR2表达与各免疫调节剂的相关性。

1.5 GSEA

使用GSEA软件Java 4.0版对TLR2进行功能富集分析。从TCGA数据库中下载各种肿瘤的表达谱文件, 每组数据根据TLR2表达量由高到低进行排序, 以中位数为界将其分为TLR2高表达组和TLR2低表达组, 选择预后与TLR2表达相关的肿瘤类型, GSEA基于整体基因集进行分析, 不排除差异倍数较小的基因集, 使结果更为全面。基于京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)进行富集分析, 以研究TLR2高表达组和低表达组间的差异途径。显著性设置为错误发现率(false discovery rate, FDR) < 0.25和P < 0.05。

1.6 统计学分析

采用R语言(v4.0.3)和SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料的比较采独立样本t检验和单因素方差分析, 采用Kaplan-Meier曲线和log-rank检验比较生存差异。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 泛癌中TLR2的表达谱

利用TCGA数据库和GTEx数据库分析肿瘤组织和正常组织中TLR2的表达水平。结果显示, TLR2表达在16种肿瘤中显著上调, 包括多形性胶质细胞瘤(GBM)、胶质瘤(GBMLGG)、脑低级别胶质瘤(LGG)、子宫内膜癌(UCEC)、食管癌(ESCA)、胃和食管癌(STES)、肾乳头状细胞癌(KIRP)、混合肾癌(KIPAN)、胃癌(STAD)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、肾透明细胞癌(KIRC)、甲状腺癌(THCA)、胰腺癌(PAAD)、睾丸癌(TGCT)、肾嫌色细胞癌(KICH)、胆管癌(CHOL), 在13种肿瘤中显著下调, 包括乳腺浸润癌(BRCA)、肺腺癌(LUAD)、结肠癌(COAD)、结直肠癌(COADREAD)、前列腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)、肝细胞癌(LIHC)、肾母细胞瘤(WT)、黑色素瘤(SKCM)、子宫肉瘤(UCS)、白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(LAML)、肾上腺皮质癌(ACC)。其中, TLR2在LAML中的相对表达量较高, 提示其在LAML中发挥重要功能。见图 1。

2.2 TLR2表达与患者预后的相关性

生存分析结果显示, TLR2在7种肿瘤中HR > 1, 表明TLR2高表达是其危险因素, 包括GBMLGG、LGG、LAML、KIPAN、胸腺癌(THYM)、睾丸癌(TGCT)、LIHC (图 2A~2G), 在7种肿瘤中HR < 1, 表明TLR2高表达是其保护因素, 包括LUAD、KIRP、SKCM、转移性黑色素瘤(SKCM-M)、间皮瘤(MESO)、ALL、肉瘤(SARC)(图 2H~2N)。

2.3 TLR2在泛癌中的基因变异情况

采用cBioPortal数据库分析泛癌中TLR2基因变异情况。泛癌中TLR2基因变异频率由高到低前3位的肿瘤分别是UCEC、SKCM和SARC, 最常见的基因变异类型是基因突变(图 3A)。基因扩增在所有肿瘤中出现频率最低, SARC中同时存在基因突变、基因扩增和基因缺失3种变异类型。本研究共检测到TLR2的148个突变位点(包括129个错义突变位点和19个截断突变位点), 位于氨基酸0~784之间。见图 3B。

2.4 TLR2表达与免疫细胞浸润的相关性

由于TLR2表达与绝大多数肿瘤中免疫细胞浸润呈显著正相关, 因此采用TIMER数据库分析TLR2表达与150种免疫调节剂(包括趋化因子、受体、组织相容性复合体、免疫抑制剂和免疫激动剂)的相关性。SARC中, TLR2表达与CSF1R、HAVCR2、IL-10、PDCD1LG2等免疫刺激剂的反应呈正相关。而在THYM中, TLR2表达与免疫抑制剂CD244、CD96、PDCD1、BTLA等呈负相关, 这可能与采用程序性死亡受体1治疗THYM却未取得显著疗效相关。见图 4。

2.5 GSEA富集分析

为了进一步阐明TLR2的生物学功能, 采用GSEA软件Java 4.0版分析KEGG数据库中TLR2高表达组和低表达组差异富集的信号通路。结果显示, TLR2主要富集于各种免疫和炎症相关通路, 如白细胞跨内皮迁移通路、TLR信号通路、JAK-STAT信号通路、B细胞受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等。见图 5。

3 讨论

TLR在免疫反应的激活中起关键作用, 是促进肿瘤细胞存活的肿瘤微环境中慢性炎症的关键介质。TLR2是TLR家族中研究最广泛的成员之一。TLR2在大多数肿瘤中上调, 与肿瘤转移密切相关, 作为原癌基因发挥重要作用。研究^[7]报道, TLR2诱导剂FSL-1可以影响纤维肉瘤小鼠体内肿瘤细胞的生长。胶质瘤中, TLR2促进肿瘤细胞免疫逃避。TLR2多态性与乳腺癌风险相关, 并有助于癌细胞侵袭^[8]。

本研究采用TCGA数据库分析34种肿瘤中TLR2的表达水平, 结果显示, 肿瘤组织和正常组织间TLR2表达存在显著差异。与正常组织相比, GBM、GBMLGG、LGG、UCEC、ESCA、STES、KIRP、KIPAN、STAD、HNSC、KIRC、THCA、PAAD、TGCT、KICH、CHOL中TLR2表达水平显著上调, BRCA、LUAD、COAD、COADREAD、PRAD、LUSC、LIHC、WT、SKCM、UCS、ALL、LAML、ACC中TLR2表达水平显著下调。TLR2在不同类型肿瘤组织中的表达水平存在差异, 可能反映其不同的基本功能, 进而影响肿瘤患者的预后。

本研究采用R语言进行生存分析, 结果表明, TLR2高表达在GBMLGG、LGG、LAML、KIPAN、THYM、TGCT、LIHC中是危险因素, 在LUAD、KIRP、SKCM、SKCM-M、MESO、ALL、SARC中是保护因素, 其具体机制值得进一步研究。

越来越多的研究^[9]表明, 基因突变参与肿瘤的发生、进展和化疗耐药。最近的一项研究^[10]表明, 基因突变引起的Rac1活性升高或表达增加, 可促进肿瘤的发生、发展、转移和侵袭, 导致患者预后不良。还有研究^[11]发现, 多种基因的编码和非编码突变以及表观突变都对前列腺癌的预后影响巨大。本研究发现, TLR2突变在SARC、SKCM和UCEC中较为常见, 这可能与其作为肿瘤保护因素的缺失相关。

本研究进一步探索TLR2在泛癌中的作用机制, 结果发现, TLR2表达与肿瘤组织的免疫浸润水平显著相关。在大多数肿瘤中, TLR2的表达与B细胞、CD4⁺ T细胞数量呈正相关, 然而在GBMLGG、LGG中却呈负相关, 这是TLR2成为GBMLGG、LGG预后危险因素的原因之一。同时, TLR2高表达可以募集更多的巨噬细胞、自然杀伤细胞, 并发挥抗肿瘤作用。这可能是LUAD、KIRP、SKCM、SARC等肿瘤中TLR2高表达患者预后较好的原因之一。在绝大多数肿瘤中, 免疫细胞浸润与TLR2表达呈显著正相关, 由此推测, 在泛癌中TLR2参与了肿瘤的炎症反应过程, 与肿瘤免疫微环境密切相关。

基于上述结果, 本研究采用R语言分析了TLR2表达与150种免疫调节剂(免疫激动剂、免疫抑制剂、趋化因子、感受器和主要组织相容性复合体分子)的关系。绝大部分肿瘤中, TLR2表达与CSF1R、HAVCR2、IL10、PDCD1LG2等免疫刺激剂反应呈正相关。研究^[12]表明, 在小鼠THYM模型中TLR2通过抑制主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(CD244、CD96、BTLA、PDCD1等)在小胶质细胞中的表达, 阻碍了CD4⁺ T细胞的增殖和活化, 从而促进了THYM免疫逃避。TGCT中, TLR2的表达与幼稚B细胞和滤泡辅助性T细胞呈负相关, 表明TLR2的促肿瘤作用抑制了部分免疫反应。骨肿瘤的研究^[13]证实, 在骨肉瘤、卡西波肉瘤中, 通过刺激TLR4可以激活自身免疫, 有利于患者的预后, 但尚不明确TLR2在骨肿瘤中的作用机制。已有基础研究^[14]表明, TLR2激动剂可能导致肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞中的TLR2活化, 影响肿瘤发展。还有研究^[15]表明, 粪肠球菌脂磷壁酸和TLR2激动剂联合应用可上调人成骨肉瘤细胞中核因子κB的表达水平。上述研究结果与本研究结果一致, 表明TLR2可以作为泛癌中一个关键的免疫调节靶点, 同时为接下来研究肉瘤中TLR2的表达及作用机制提供了理论依据。

本研究存在一定的局限性。首先, 需进行进一步实验确定TLR2在不同肿瘤发生中精确的分子功能, 并通过PCR、Western blotting等方法验证TLR2在泛癌中的表达。其次, TCGA数据库中的样本量有限, SARC中正常样本量过少, 可能导致分析结果存在一定偏差。再有, 需要更多的外部数据集验证TLR2与肿瘤免疫微环境的关系。

综上所述, 本研究对TLR2进行的泛癌分析结果表明, TLR2可以作为一个新的免疫调节靶点, 影响肿瘤的预后, 从而为癌症的临床诊疗提供一定的理论支持。