P物质(substance P，SP) 最初被认为是感觉神经递质，广泛分布于中枢和外周神经系统，可参与机体多种生理病理过程，包括疼痛感知，免疫细胞增殖、趋化及炎症等，并在心血管、呼吸和消化系统中发挥作用^[1-3]。许多免疫细胞也可产生SP，SP在免疫系统中以旁分泌和自分泌的形式调节免疫细胞功能，如促进免疫细胞增殖和分化，影响免疫球蛋白的合成及细胞因子分泌等^[4-5]。SP还通过调节趋化因子和黏附分子的表达，对免疫细胞的迁移发挥重要调节作用^[5-6]。SP的生物学功能由3种受体NK-1R、NK-2R、NK-3R介导，其中NK-1R与SP的亲和力最高，故NK-1R为主要介导者^[7-8]。研究^[9]表明，NK-1R信号转导通路是T细胞活化的最佳Ca²⁺通量所必需的。CD4和CD8 T细胞都表达功能性NK-1R，在同源T细胞活化过程中自分泌/旁分泌的SP激活NK-1R信号转导通路，从而增加T细胞受体(T cell receptor，TCR) 信号转导后的Ca²⁺通量，这种作用对于后续的启动白细胞介素-2 (interleukin-2，IL-2) 合成、T细胞存活以及辅助性T (helper T，Th) 细胞1和Th17细胞极化的下游信号通路是必需的。

自然杀伤(natural killer，NK) 细胞是固有免疫的主要承担者，在机体早期抗感染、抗肿瘤免疫中发挥重要作用^[10-11]。NK细胞识别靶细胞后激活，受控于自身共表达的活化性受体和抑制性受体的动态信号平衡^[11-13]。研究^[14-15]证明，SP对NK细胞功能具有调节作用，SP可刺激NK细胞迁移及细胞毒活性^{[6, 15]}。另有研究^[16]发现，某些病理状态下，循环SP浓度升高可损伤NK细胞功能，抑制NK细胞杀伤活性。说明SP在不同条件下对NK细胞的作用不同，提示SP对NK细胞的调控作用具有复杂性和多样性，SP主要通过NK-1R调节NK细胞功能^[16-17]，但确切的信号通路及机制还不十分明确。本研究选用NK92-MI细胞作为研究体系，体外研究SP对NK92-MI细胞增殖、杀伤活性的影响，并探讨SP受体NK-1R在SP调控NK细胞活性中的作用及可能的信号分子机制。

1 材料与方法 1.1 材料

NK92-MI细胞为非IL-2依赖的NK92细胞株，购自中科院上海细胞库。SP购自美国Sigma公司。抗NK-1R单克隆抗体、抗环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB)/p-CREB单克隆抗体购自美国abcam公司。FITC标记的二抗购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

用含12.5%胎牛血清和12.5%马血清的α-MEM培养基(不含RNA和DNA)，在37 ℃、5%CO2培养箱中传代培养NK92-MI细胞。

1.2.2 MTT释放法检测SP对NK92-MI细胞增殖的影响

NK92-MI细胞(1×10⁵/mL) 接种于96孔培养板(100 µL/孔)，加入10^-12 mol/L的SP (100 µL/孔)，于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育；分别于孵育24、48和72 h加入MTT液，继续孵育4 h；加入DMSO和甘氨酸缓冲液溶解甲臜结晶，用酶标仪于570 nm处测定吸光度(optical density，OD) 值。用特异性NK-1R拮抗剂[D-Arg1，D-Phe5，D-Trp7，D-Trp9，Leu11] SP (10-7 mol/L) 预处理NK92-MI细胞30 min，再用10^-12 mol/L SP作用48 h，MTT法检测NK92-MI细胞的增殖活性。

1.2.3 MTT释放法检测SP对NK92-MI杀伤活性的影响

(1) 将4×10⁵/mL的NK92-MI细胞作为效应细胞接种至96孔培养板(100 µL /孔)，加入10^-12 mol/L SP (100 µL /孔) 作用24 h；将1×10⁵/mL的K562细胞作为靶细胞，接种至实验孔(100 µL /孔)，使效靶细胞比为4∶1；效靶细胞共同孵育4 h后，加入MTT液孵育4 h；加入DMSO和甘氨酸缓冲液，振荡15~20 min后，用酶标仪测定570 nm OD值。计算NK-92MI细胞对K562细胞的杀伤率，杀伤率(%) = [1-(杀伤实验组OD值-效应细胞对照组OD值) /靶细胞对照组OD值]×100。(2) 用特异性NK-1R拮抗剂预处理NK92-MI细胞30 min，再用10^-12 mol/L SP作用24 h，MTT法检测NK92-MI细胞对K562细胞的杀伤活性。

1.2.4 荧光定量PCR

采用TRIzol法提取NK92-MI细胞总RNA，经37 ℃、15 min反转录，反应体系10 μL [5×Prime Script^TM Buffer 4.0 μL，Prime Script^TM Enzyme MixⅠ 0.5 μL，50 μmol/L Oligo dT primer 0.5 μL，100 μmol/L random 6 mers 0.5 μL，total RNA (﹤500 ng) 1.0 μL，RNase Free dH₂O 3.5 μL]。PCR反应为两步法，95 ℃30 s预变性；95 ℃5 s，60 ℃34 s，40个循环。PCR反应体系20 μL [SYBY Primix Ex Taq^TM (2×) 10 μL，PCR上下游引物(10 μmol/L) 各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μL，模版cDNA 2.0 μL，dH₂O 6.8 μL]。用Primer Premier 5.0软件设计NK-1R引物，由金思特科技有限公司(南京) 合成。引物序列，正向5’-tccactaacacctcggaacc-3’，反向5’-acaggccgtagtaccattgg-3’。应用ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System进行检测，以18SrRNA作为参照基因，用2^-ΔΔCt法比较实验组相对表达量与对照组的倍数差异^[18]，ΔΔCt =实验组ΔCt-对照组ΔCt。

1.2.5 流式细胞术检测NK-1R的膜表达

用10^-12 mol/L SP处理NK-92MI细胞24 h，收集、洗涤细胞，加入无标记的抗NK-1R单克隆抗体，4 ℃孵育40 min；洗涤细胞后，再加入FITC标记的二抗，4 ℃继续孵育40 min，洗涤细胞后应用FACScan流式细胞仪进行检测分析。

1.2.6 Fura-2/AM荧光探针法检测NK92-MI细胞胞质钙浓度

用10^-12 mol/L SP处理NK-92MI细胞1 h，收集、洗涤细胞，加入Fura-2/AM/DMSO液(终浓度为5 μmol/L)，37 ℃避光振荡孵育30 min；洗涤细胞后于25 ℃放置30 min，使Fura-2/AM完全去酯化；上机测定荧光强度F，加入10%Triton X-100 (10 μL)，测定饱和Ca²⁺溶液的荧光强度F_max；各管加入EGTA 10 μL，测定零Ca²⁺溶液的荧光强度Fmin。按下列双波长探针测定的计算公式计算胞质Ca²⁺浓度，钙含量[Ca²⁺] = Kd× (R-R_min) / (R-R_max)×F2_min/F2_max，R=Fλ1/ Fλ2，R_min = F1_min/F2_min，R_max= F1_max/F2_max。Fλ1和Fλ2分别为在波长λ1与λ2时的荧光强度；F1_min和F2_min分别为零Ca²⁺溶液在波长λ1与λ2时的荧光强度；F1max和F2_max分别为饱和Ca²⁺溶液在波长λ1与λ2时的荧光强度。

1.2.7 Western blotting测定CREB磷酸化水平

用10^-12 mol/L SP作用NK-92MI细胞1 h，收集1×10⁷个细胞，提取细胞总蛋白并定量，行聚丙烯酰胺凝胶电泳。室温、50 V (100 mA) 转印PVDF膜3 h。转印膜漂洗后，加入封闭液(10%牛奶) 于4 ℃摇床封闭过夜。加入抗CREB/p-CREB单克隆抗体(1∶1 000稀释)，室温孵育2.5 h；漂洗后，加入二抗(1∶2 000稀释) 孵育1 h。以β-actin作为内参照。用ECL试剂显影、检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 SP促进NK92-MI细胞增殖活性

MTT结果显示，10^-12 mol/L SP可促进NK92-MI细胞的增殖活性，且作用48 h促增殖活性最强(图 1A)。NK-1R拮抗剂可完全阻断SP的促增殖活性(图 1B)。提示SP通过NK-1R发挥其对NK细胞的促增殖活性。

2.2 SP对NK92-MI细胞杀伤活性的影响

MTT结果显示，经10^-12 mol/L SP作用24 h后，NK92-MI细胞对K562细胞的杀伤活性(效靶细胞比为4∶1) 明显增强(P < 0.01)，且NK-1R拮抗剂可大部分阻断SP的增强作用(图 2)。

2.3 SP启动NK-1R受体及Ca²⁺信号通路

荧光定量PCR结果显示，10^-12 mol/L SP作用1 h即可促进NK92-MI细胞的NK-1R mRNA表达，作用4 h使NK-1R mRNA表达上调至最高水平；至24 h时，NK-1R mRNA表达水平回落至正常(图 3A)。10^-12 mol/L SP作用1~4 h，NK92-MI细胞的NK-1R膜表达无明显变化，作用至24 h，NK-1R的膜表达明显增加(图 3B、3D)。同时发现，SP作用1 h即可引起NK92-MI细胞胞质Ca²⁺浓度明显升高，而作用至24 h，Ca²⁺浓度回落至基础水平(图 3C)。上述结果表明，SP通过增加NK-1R的表达及激活Ca²⁺信号通路，发挥对NK92-MI细胞活性的调节作用。

2.4 SP诱导NK92-MI细胞CREB磷酸化

选择NK-1R mRNA表达水平和Ca²⁺浓度均增高的时间点，检测CREB的磷酸化状态。结果显示，未受SP作用的NK92-MI细胞p-CREB水平较低，10^-12 mol/L SP作用1 h后p-CREB的水平明显增高，表明SP可诱导CREB磷酸化而活化CREB。

3 讨论

本研究发现，SP可有效促进NK92-MI细胞的增殖和杀伤活性，且该促进作用可被SP受体(NK-1R) 拮抗剂完全阻断和大部分阻断。另一方面，SP可诱导NK92-MI细胞NK-1R的表达增加，说明SP可通过NK-1R的表达来介导其对NK92-MI细胞活性的促进作用。

NK-1R广泛分布于神经系统和免疫系统，且在免疫系统中主要参与介导调节功能^{[6, 19]}。NK-1R为G蛋白耦联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)，与高亲和性配体相互作用，通过不同的G蛋白产生不同的第二信使而发挥作用。主要有2条下游信号转导途径，环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP) 信号途径和磷脂酰肌醇信号途径。NK-1R与Gαq蛋白作用诱导磷酯酶C活化，导致胞内三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3) 和甘油二酯迅速产生，并增加胞质Ca²⁺作为第二信使^{[9, 11, 20]}。cAMP则被与NK-1R结合的Gαs蛋白激活^{[5, 11]}。NK-1R与SP结合活化可激活几种第二信使，包括钙(Ca²⁺)、IP3、蛋白激酶C、促分裂原活化蛋白激酶和转录因子核因子κB及CREB等^[20-21]。SP与NK-1R结合通过Gαs激活腺苷环化酶，使cAMP水平升高，而激活依赖于cAMP的蛋白激酶A (protein kinase A，PAK)；活化的PAK进入细胞核内，使转录因子CREB磷酸化，从而具有转录活性，启动下游基因的转录，完成信号转导途径^[21-22]。

前期研究^[17]结果显示，SP通过NK-1R介导胞质Gαs的上调和Cαi信号通路参与了其增强NK92-MI细胞杀伤活性及对杀伤介质穿孔素和颗粒酶B表达的促进作用。本研究结果表明，SP可促进NK92-MI细胞胞质Ca²⁺浓度迅速升高，提示Ca²⁺依赖的信号通路启动了NK-1R，或部分参与了NK-1R介导的SP活化NK92-MI细胞的信号转导。

本研究结果显示，SP通过增加CREB的磷酸化而活化CREB。CREB是一种碱性亮氨酸拉链转录因子，可由细胞外调节蛋白激酶、Ca²⁺和应急刺激等信号通过Ser133位点的磷酸化来激活，继而选择性活化一系列下游基因^[23-24]。前期研究数据表明，SP可在转录水平调节NK细胞的活性，即上调杀伤介质穿孔素、颗粒酶B以及受体NCRs、NKG2D和NKG2A的mRNA水平。

综上所述，本研究发现cAMP通路参与了NK-1R介导的SP对NK92-MI细胞的活化，且Ca²⁺和CREB是关键信号分子，这些结果有助于更好地了解SP调控NK细胞功能的作用机制。