文章信息
- 曲浩宁, 朱文韬, 何群
- QU Haoning, ZHU Wentao, HE Qun
- 基于生物信息学构建阿尔茨海默病内源竞争RNA调控网络
- Construction of regulatory network of competing endogenous RNA in Alzheimer's disease based on bioinformatics analysis
- 中国医科大学学报, 2022, 51(2): 169-173
- Journal of China Medical University, 2022, 51(2): 169-173
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文章历史
- 收稿日期:2021-04-22
- 网络出版时间:2021-12-30 16:55
我国阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者数量随着人口老龄化而不断增加[1]。AD是一种渐进性中枢神经退行性疾病,目前认为AD的主要致病机制有β-淀粉样蛋白(Aβ)生成增加、tau蛋白沉积、神经系统免疫炎症反应、氧化应激损伤、糖代谢异常等[2-3]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在神经退行性疾病中有重要作用,并可能通过竞争性结合微RNA(microRNA,miRNA)形成复杂的内源竞争RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络,从而引发神经退行性疾病[4]。
lncRNA是一组长度不小于200个核苷酸、没有明显编码蛋白潜能的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)[1]。研究[2-4]表明,lncRNA在转录和转录后水平参与基因表达的调控,并具有明显的组织特异性、细胞特异性、时空特异性和发育阶段特异性,其变化和发育也与疾病状态有关,故在多种疾病的进展中起着关键作用。lncRNA有多种功能,细胞质中的lncRNA可以诱捕miRNA与之结合,通过ceRNA机制竞争性地结合miRNA来调节基因表达。[5]
1 材料与方法 1.1 筛选差异表达靶基因从基因表达综合数据库(gene expression omnibus,GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载数据GSE28146,使用GEO数据库GEO2R以P < 0.05为条件分别筛选AD轻度组、中度组和重度组与正常对照组比较的差异基因(differentially expressed genes,DEGs),AD轻度组筛选出DEGs 2 612个,AD中度组筛选出DEGs 3 120个,AD重度组筛选出DEGs 3 187个。应用Venny 2.1.0 [Venny 2.1.0(csic.es)],取轻、中、重度组DEGs的交集为候选差异基因(candidate differentially expressed genes,pDEGs),在pDEGs中筛选差异表达的lncRNA进行后续分析。
1.2 lncRNA靶基因的预测及富集分析利用在线分析工具RegRNA(http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/)预测lncRNA的靶基因。RegRNA是专门用来进行RNA功能性的motif预测网站,该网站预测内容包含转录motif、mRNA降解原件、RNA-RNA结合、翻译预测等功能。
1.3 预测lncRNA的亚细胞定位应用lnclocater(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/)和iLoc-mRNA(http://lin-group.cn/server/iLoc-mRNA/predictor.php)对lncRNA的亚细胞定位进行预测,找到lncRNA具体存在的细胞位置。
1.4 miRNA靶基因的预测应用miRDB(https:/www.mirdb.org/)、TargetScan(https://www.targetscan.org/)和TargetMiner(https://www.isical.ac.in/~bioinfo_miu/final_html_targetminer/hsa-miR-1254.html)3个在线数据库预测mRNA的靶基因,并用Venny 2.1.0绘制韦恩图,将此3个数据库得到的靶基因与GSE28146数据集中轻、中、重度3组共有的表达上调的pDEGs取交集作为最后miRNA靶基因集合。将靶向基因集提交DAVID(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)网站以P < 0.05为条件进行基因本体(gene ontology,GO)分析和PATHWAY分析。
1.5 ceRNA网络的构建及其富集分析将靶向基因集提交DAVID(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)网站以P < 0.05为条件进行GO富集分析分析和PATHWAY分析。使用Cytoscape(3.8.0版)绘制ceRNA网络,构建GSE28146数据集中pDEGs得蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络并用cytoscape找到其关键基因,与miRNA靶基因集合做交集,以确定ceRNA网络中的lncRNA在疾病中是否有关键作用,调控关键蛋白。
2 结果 2.1 共有差异lncRNA的筛选结果AD轻度组筛选出DEGs 2 612个,中度组筛选出DEGs 3 120个,重度组筛选出DEGs 3 187个。为了筛选在AD中其关键作用的基因,取早中晚3组与正常相比异常的252个DEGs,然后从数据集GSE28146中早中晚差异表达的pDEGs中筛选出LINC02047、LINC01124、LINC00582和LINC02478,均为表达上调基因。
2.2 lncRNA的亚细胞定位为了分析这些差异lncRNA是否参与ceRNA竞争机制,利用lnclocater和iLoc-mRNA网站对其亚细胞定位进行分析,结果显示,LINC02047、LINC01124和LINC02478定位于细胞质,见表 1。
lncRNA name | Subcellular localization | Score | Site |
LINC02047 | cytoplasm | 0.886 872 617 43 | lnclocater |
LINC01124 | cytoplasm | 0.636 895 332 326 | lnclocater |
LINC02478 | cytoplasm | 0.967 674 | iLoc-mRNA |
2.3 lncRNA靶基因的预测结果
RegRNA预测LINC02047的靶基因为hsa-miR-132-3p,LINC011124的靶基因有4个,分别为hsa-miR-1254、hsa-miR-4640-5p、hsa-miR-4690-3p和hsa-miR-4786-3P,LINC02478的靶基因为hsa-miR-3612。
2.4 miRNA靶基因的预测结果使用数据库miRDB、TargetMiner和TargetScan分别预测hsa-mir-132-3p、hsa-mir-1254、hsa-mir-3612、hsa-mir-4640-5p、hsa-mir-4690-3p、hsa-mir-4786-3p的靶基因。其中hsa-mir-132-3p用在线韦恩图工具Venny 2.1.0可得到靶基因交集126个,占总数4.4%。hsa-mir-1254靶基因交集722个,占总数11.6%。hsa-mir-3612靶基因交集290个,占总数3.3%。hsa-mir-4640-5p靶基因交集231个,占总数的3.3%(图 1)。hsa-mir-4690-3p靶基因交集126个,占总数2.2%。hsa-mir-4786-3p靶基因交集234个,占总数的3.4%。再将3个数据库预测到的靶基因交集在与早中晚3组共有表达上调的pDEGs取交集,见表 2。GO富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes,KEGG)通路分析结果见表 3、4。
miRNA name | Name of mRNA intersection |
hsa-miR-132-3p | LIN28B,CAPRIN1 |
hsa-miR-1254 | TRIM37,BCL2L1,WASL,CSNK1G3,DLGAP2,POLR2D,HEMK1,NMNAT2 |
hsa-miR-4640-5p | THRB |
hsa-miR-4690-3p | STRBP,SVOP |
hsa-miR-4786-3p | LGALSL,HEMK1,GLI3,NR2F2 |
hsa-miR-3612 | CSNK1G3,NOS1,UBE3A,FBXO21 |
Type | Notes | n | P |
GOTERM_BP_DIRECT | ovarian follicle development | 2 | 0.02 |
GOTERM_BP_DIRECT | fertilization | 2 | 0.02 |
GOTERM_MF_DIRECT | steroid hormone receptor activity | 2 | <0.05 |
Type | Notes | Genes | P |
KEGG_PATHWAY | Hedgehog signaling pathway | CSNK1G3,GLI3 | 0.03 |
KEGG_PATHWAY | RNA polymerase | POLR2D | 0.04 |
2.5 构建ceRNA网络
将所得lncRNA、miRNA与mRNA在cytoscape3.8.0中绘制出ceRNA网络,共21条通路,30个节点,27条边。见图 2。构建PPI网络后经cytoscape hubba分析得分较高的基因与miRNA交集后得到了4个得分较高的关键基因,分别为NMNAT2、DLGAP2、SVOP和UBE3A,得分分别为20 541、17 936、12 362和95。
3 讨论
AD是全球痴呆最常见的类型,全球约有4 000万人患有AD,并且患病率逐年上升[7-8]。lncRNA的DEGs已被证实与神经退行性疾病的发生发展有密切关系[9],但尚无在AD调控网络作用机制中针对lncRNA的差异表达研究。
为了寻找与AD相关的关键lncRNA,本研究选取了GEO数据库GSE28146,分析了其正常组织与各个时期AD病例组织中DEGs,筛选差异表达的lncRNA。其中,LINC02047、LINC01124和LINC02478在AD早期、中期和晚期的病理组织中均存在差异。为进一步探讨上述3种lncRNA在AD发病机制中起到的关键作用,本研究通过亚细胞定位确定了这3个lncRNA在细胞质中的表达,表明上述lncRNA可通过ceRNA机制调控基因表达参与AD发病。
RegRNA预测结果显示,lncRNA通过调控miRNA而影响神经退行性病变中的基因表达。LINC01124具有抑制细胞增殖、迁移和侵袭的能力[10];miR-132被证实是AD神经元中最显著下调的miRNA,miR-132可促进神经突起的延长和分支,减少神经元死亡[11];miR-1254通过与靶区的非结构位点结合也可以起到阻遏作用[12],以上结果揭示了ceRNA的部分调控关系,然而对于LINC01124,LINC02478,miR-4060,miR-4090,miR-4786,miR-3612的分子机制及其如何作用于神经退行性病变,迄今尚无研究阐明。
基于lncRNA-miRNA-mRNA调控关系,本研究对各项功能节点的可信度进行了筛选,并对ceRNA的调控过程构建了可视化网络。基于David对ceRNA网络进行分析的结果,基因组整体展现了抑制细胞增殖、迁移和侵袭与类固醇激素受体的功能。
KEGG通路分析提示其参与Hedgehog信号通路。Hedgehog信号通路在人胚胎干细胞神经分化的d6~d14持续活化,而Sonic Hedgehog作为Hedgehog信号通路家族成员之一,对基底前脑胆碱能神经元(basal forebrain cholinergic neurons,BFCNs)的发育分化起到至关重要的作用[13]。BFCNs投射系统的退行性病变是导致AD患者出现空间认知功能障碍的主要原因[14]。枢纽基因NMNAT2的缺失可能会导致自发性的轴突变性,使轴突运输受阻,进而引发AD [15-17];Dlgap2和AD表型在变异、基因和蛋白质表达以及甲基化水平上存在关联[18];Ube3A的缺失触发Arc和Ephexin-5的积累,分别驱动GluR1的内化和RhoA的激活,最终导致突触的剪断被Ube3A的恢复所阻断[19];神经元表达转运蛋白SV2相关蛋白(SVOP和SVOPL)在调节胞吐中起到关键作用[20]。
本研究利用生物信息学软件挖掘了各时期AD中共差异表达的lncRNA,并绘制了其与靶向miRNA、mRNA的ceRNA网络图。结果验证了部分已被阐明的AD作用机制,同时也发现了尚未得到充分研究且可能成为潜在药物靶点的重要lncRNA与miRNA。本研究基于临床样本数据,探寻各期AD存在的共同差异,构建了完整的ceRNA调控网络,为AD分子机制的深入研究提供了严谨的数据支持。
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