含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2（WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2，WWP2）是NEDD4样蛋白家族中的一种E3泛素连接酶^[1-2]。它可将泛素连接至靶蛋白，并促使蛋白酶体降解靶蛋白^[3-4]。E3泛素化连接酶参与了氧化应激相关过程，在多种疾病的发生发展中发挥重要的调控作用^[3-5]。研究^[6-9]表明，泛素化与肿瘤的发生密切相关，与血液系统疾病，如淋巴瘤、骨髓瘤、再生障碍性贫血、急性白血病也有一定联系。p21，也称CDKN1A/CIP1/WAF1/SDI1，是首个被鉴定出的细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）复合物抑制剂^[10]，最近的研究发现，p21在抑制肿瘤中发挥重要作用，可能成为新治疗策略的重点。目前已报道的WWP2底物有Gsc、PTEN、TGFβ、Smads、EGR2以及Oct4等^[11-15]。然而，WWP2与p21之间的作用尚不清楚。因此，本研究拟探讨E3泛素连接酶WWP2与p21的相互作用，及WWP2通过蛋白酶体途径降解p21的机制，为肿瘤的治疗及研究提供新思路。

1 材料与方法 1.1 材料

HEK 293T细胞系（人肾上皮细胞系衍生株）来自中国医科大学健康科学研究所心血管内科研究室。MG132、放线菌酮（cycloheximide，CHX）购自美国ApexBio公司；WWP2质粒购自中国锐博生物公司；anti-HA、anti-GAPDH、anti-p21、二抗试剂购自美国Proteintech公司；anti-WWP2购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养液，在37 ℃、5%CO₂饱和湿度孵箱中培养HEK 293T细胞。根据细胞生长状态、生长密度换液、传代。

1.2.2 细胞转染

用PBS缓冲液洗涤待转染的细胞（生长密度约70%），并更换新鲜培养基，用Lipofectamine 3000转染试剂行过表达WWP2质粒转染。室温下孵育15~20 min，缓慢将转染体系吹匀后滴入培养基中并晃匀，置入孵箱继续培养6~8 h后，更换培养液，继续培养至转染后48 h，收取细胞进行后续实验。用PBS缓冲液洗涤待转染的细胞（生长密度约70%），并更换新鲜培养基，用jetPrime转染试剂进行WWP2 siRNA转染。室温下孵育15~20 min，缓慢将转染体系吹匀后滴入培养基中并晃匀，置入孵箱继续培养12~24 h，更换培养液，继续培养至转染后72 h，收取细胞进行后续实验。

1.2.3 Western blotting

用蛋白质合成抑制剂CHX（50 μmol/L）或蛋白酶体抑制剂MG132（50 μmol/L）处理过表达或敲减WWP2的293T细胞0、4、8 h后，收集细胞并裂解，4 ℃、13 300 r/s离心20 min，收集蛋白。BCA法行蛋白定量后上样，行SDS电泳，4 ℃、恒流200 mA、120 min将蛋白转至PVDF膜。5%BSA室温封闭1 h。加入一抗（用含有1%BSA的TBST试剂1∶1 000稀释），4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜3次，加入对应的二抗，室温孵育1 h，TBST缓冲液漂洗膜3次。过氧化物酶法显色，用Image J软件测量条带灰度值。GAPDH作内参照。

1.2.4 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）实验

蛋白制备及定量步骤同Western blotting。在Co-IP蛋白样品中加入1~3 μL相应抗体后，于4 ℃混转3 h后，加入30 μL beads并混匀，4 ℃混转过夜。弃上清，加入1 mL细胞裂解液，4 ℃混转10~15 min，重复3次。加入25~30 μL 2×Loading Buffer，与input同在沸水中加热7 min，瞬离后备用。后续实验步骤同Western blotting。

1.3 统计学分析

所有图片用Photoshop2019、Adobe Illustrator 2019软件处理后，以GraphPad Prism8作图，并采用SPSS 25.0软件进行统计分析。数据以x±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用One-way ANOVA分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 WWP2与p21相互作用

通过Co-IP及Western blotting检测293T细胞中WWP2与p21的结合情况。结果显示，WWP2与p21之间存在结合（图 1）。

2.2 WWP2可调节p21的表达水平

Western blotting结果显示，在293T细胞中过表达WWP2，p21的表达水平明显降低（图 2A）。且随着WWP2表达量的增加，p21的表达水平相应降低（图 2C）。而敲减WWP2后，p21的表达水平相应增加（图 2B）。以上结果说明WWP2可影响p21的表达水平，调控p21的稳定性，提示WWP2可能通过蛋白酶体途径降解p21。

2.3 CHX处理WWP2过表达及敲减细胞系

用CHX处理过表达WWP2的293T细胞0、4、8 h。如图 3A所示，随着CHX作用时间延长，对照组和过表达组p21的表达水平均逐渐下降。过表达WWP2使p21的半衰期缩短，表明过表达WWP2可降低p21蛋白的稳定性。用CHX处理敲减WWP2的293T细胞0、4、8 h。如图 3C所示，随着CHX作用时间的延长，对照组和敲减组p21的表达水平均逐渐升高。敲减WWP2使p21的半衰期延长，表明敲减WWP2能增加p21蛋白的稳定性。以上结果提示，WWP2能降低p21的表达水平。

2.4 MG132处理WWP2过表达及敲减细胞系

MG132作用WWP2过表达293T细胞0、4、8 h，用Western blotting检测WWP2、p21和内参GAPDH的表达情况。结果如图 4A所示，随着MG132作用时间的延长，对照组和过表达组p21的表达水平均逐渐上升。相对于过表达组，HA-空载组p21蛋白表达在MG132处理后变化更显著。说明WWP2能降低p21的表达水平，MG132可阻断WWP2对p21的负性调控，使内源性p21的累积增加。

MG132作用WWP2敲减293T细胞0、4、8 h，用Wes-tern blotting检测WWP2、p21和内参GAPDH的表达情况。结果如图 4C所示，随着MG132作用时间的延长，对照组和敲减组p21的表达水平均逐渐上升。相对于未敲减组，敲减组p21蛋白表达在MG132处理后变化更显著。说明WWP2使p21的表达水平下降。

以上均提示体系中p21的降解依赖于蛋白酶体途径，证实了WWP2通过蛋白酶体途径介导p21的降解。

3 讨论

WWP2可将泛素连接至靶蛋白，并促使蛋白酶体降解靶蛋白^[3]。研究表明，泛素化不仅与肿瘤的发病密切相关^[4]，还与抗癌药物的耐药性相关^[16]。近年来，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21在抑瘤功能中的重要性突显，并因此成为研究治疗策略的重点。

WWP2是泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）的成员之一，该系统是蛋白质降解的主要通路之一，多种蛋白的调节功能与这一系统密切相关。本研究结果发现，WWP2与p21之间存在结合。过表达WWP2使293T细胞p21蛋白表达水平降低，敲减WWP2则使293T细胞p21蛋白表达水平增加，提示WWP2可调节p21的表达水平。

为了进一步确定蛋白酶体途径是否与p21蛋白降解过程有关，本研究应用蛋白质合成抑制剂CHX处理293T细胞，结果发现，对照组与实验组p21表达水平均随CHX作用时间延长而减少；且过表达WWP2后p21的半衰期缩短，敲减WWP2则使p21的半衰期延长。以上均证实WWP2并非在翻译合成的方向调控p21。

为了进一步检测293T细胞中p21的降解情况，本研究应用蛋白酶体抑制剂MG132处理293T细胞。MG132是蛋白酶体特异性抑制剂，主要通过抑制蛋白酶体系统而使相应蛋白在体内积累。结果发现，对照组和实验组p21表达水平均随MG132作用时间延长呈梯度增加。说明体系中p21的降解依赖于蛋白酶体途径。相对于过表达组，HA-空载组在MG132处理后p21变化水平更为明显。相对于未敲减组，敲减组在MG132处理后p21变化水平更为明显。表明WWP2可通过蛋白酶体途径降解p21。

综上所述，本研究首次发现E3泛素连接酶WWP2可通过蛋白酶体途径调控p21的稳定性。本研究结果有望推动WWP2及泛素化的研究，为疾病的诊疗提供理论依据。