在癌症死亡患者中肺癌占27%，是癌症相关死亡的主要原因^[1]。肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD) 已经成为近数十年来最常见的肺癌类型之一，并且LUAD倾向于早期转移，能够导致很高的死亡率^[2]。因此，寻找可靠的预后标志物和治疗靶点对提高LUAD的治疗效果非常重要。随着生物技术的发展，可以通过微阵列检测成千上万个基因的表达水平，进一步促进了癌症的研究。本研究通过分析基因表达微阵列数据(GSE33532、GSE32863和GSE43458) 探索了LUAD中差异表达基因的相互作用网络以及相关的信号传导途径，最终鉴定出3个核心基因CDC45、CCNB2和CDC20可以作为LUAD的候选生物标志，从而为LUAD的潜在生物学机制和治疗靶标提供有用的信息和方向。

1 材料与方法 1.1 微阵列数据信息

从美国国立生物技术信息中心的基因表达汇编(Gene Expression Omnibus，GEO) 数据库中选取GSE33532、GSE32863和GSE43458的芯片数据，共178例LUAD和98例正常肺组织。

1.2 差异表达基因的筛选

使用GEO2R筛选LUAD和正常肺组织之间的差异表达基因，筛选条件是| logFC |≥ 1和调整P < 0.001。然后，使用Venn diagram软件获得3个基因芯片的共同差异表达基因，log FC > 0定义为上调基因，log FC < 0定义为下调基因。

1.3 基因本体(Gene Ontology，GO) 分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) 分析

使用注释、可视化和集成发现数据库(The Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery，DAVID) 对基因进行分子功能(molecular function，MF)、细胞成分(cellular component，CC)、生物过程(biological process，BP) 和KEGG分析(P < 0.05)。

1.4 蛋白-蛋白相互作用网络(protein-protein interaction network，PPI) 的建立和重要模块的分析

通过STRING获取PPI信息。然后，使用Cytoscape检查基因之间潜在的相关性，使用MCODE获得重要模块。

1.5 核心基因的生存分析

通过Kaplan-Meier Plotter在线数据库评估基因对预后的影响(P < 0.05)。

2 结果 2.1 筛选LUAD中差异表达的基因

使用GEO2R，分别从GSE33532、GSE32863和GSE43458中筛选出3 180、1 584、1 011个差异表达基因。使用Venn diagram获得331个共同差异表达基因，其中上调基因68个(图 1A)，下调基因263个(图 1B)。

2.2 差异基因的GO和KEGG分析

使用DAVID对331个基因进行GO分析。结果表明：(1) BP方面，上调的基因主要富集在胶原纤维组织、胞质分裂和凋亡过程的正向调控等，下调的基因主要富集在细胞黏附和细胞对激素刺激的反应等；(2) MF方面，上调的基因富集在细胞外基质结构组成和DNA结合、弯曲等，下调的基因则富集在肝素结合和碳水化合物结合等；(3) CC方面，上调的基因明显富集在蛋白质细胞外基质、中体和细胞外泌体等，下调的基因富集在膜筏和蛋白质细胞外基质等。KEGG分析结果显示，上调的基因主要富集在细胞外基质受体相互作用、蛋白质的消化吸收、黏着斑和细胞周期，下调的基因则富集在细胞黏附分子、药物代谢-细胞色素P450、酪氨酸代谢和PPAR信号通路(图 2)。

2.3 PPI的构建和重要模块分析

通过STRING获取331个共同差异表达基因的PPI信息。使用Cytoscape检查基因之间潜在的相关性，共有291个节点和934层边缘。此外，使用MCODE获得了1个重要模块。该模块包括16个基因，且均为上调基因(图 3)。

2.4 使用Kaplan-Meier Plotter在线数据库进行核心基因的分析

使用Kaplan-Meier Plotter在线数据库对16个基因进行总生存分析(overall survival，OS)，结果显示，13个基因(ASPM，CCNB2，CDC20，CDC45，CENPE，KIAA0101，KIF20A，MELK，PRC1，TOP2A，TPX2，TYMS，UBE2T)的高表达与LUAD的OS更差相关(均P < 0.05)。

2.5 13个核心基因的KEGG途径分析

13个基因的KEGG分析结果表明，CDC45、CCNB2和CDC20显著富集于细胞周期途径中(P = 0.001 929 455，FDR=1.234 859 464)。

2.6 CDC45、CCNB2和CDC20的表达与不同临床病理特征肺癌患者预后的关系

使用Kaplan-Meier Plotter在线数据库分析CDC45、CCNB2和CDC20的表达与不同临床病理特征肺癌患者临床预后的关系。结果显示，CDC20的高表达与男性、女性、TNM分期中的Ⅰ期、N₂期、吸烟、腺癌和手术切缘阴性患者的OS和无进展生存期(free progression survival，FPS) 较差显著相关(表 1)，CCNB2的高表达与男性、TNM分期中的Ⅰ期、吸烟、未吸烟、腺癌和手术切缘阴性患者的OS和FPS较差显著相关(表 2)，CDC45的高表达与男性、TNM分期中的Ⅰ期、吸烟、腺癌、手术切缘阴性和未化疗患者的OS和FPS较差显著相关(表 3)。这些结果表明，CDC45、CCNB2和CDC20的表达水平可能影响肺癌患者的预后，可望成为LUAD的预后标志物。

3 讨论

为了确定在LUAD中有用的预后生物标志物，本研究使用生物信息学方法从GEO数据库中选取了GSE33532、GSE32863和GSE43458芯片，最终得到CDC45、CCNB2和CDC20在细胞周期途径中显著富集，并且这3个基因的表达与不同临床病理特征肺癌患者的预后有关，表明这3个基因可能作为LUAD的预后生物标志物和潜在治疗靶点。

CDC20突变可导致有丝分裂异常停止，从而导致后期染色体分离异常^[3]。CDC20在多种肿瘤中高表达，如卵巢癌^[4]、肝细胞癌^[5]、胃癌^[6]、乳腺癌^[7]，并与患者的预后有关。下调CDC20可增加癌细胞对放疗和化疗的敏感性^[8]。CCNB2通过激活CDK1激酶来触发细胞周期G₂/M的转变^[9]。CCNB2在多种癌症中高表达，如前列腺癌^[10]、乳腺癌^[11]、。CCNB2 mRNA在癌症患者血清中高表达，且与癌症的分期和转移状态有关^[12]。CDC45在启动DNA复制中起着至关重要的作用^[13]，且在多种肿瘤中高表达，如宫颈癌^[14]，并且CDC45可能是各种恶性肿瘤增殖的标志物^[15]。

大量研究证明，CDC20、CCNB2和CDC45与多种肿瘤进展密切相关。本研究通过生物信息学分析发现，CDC20、CCNB2和CDC45在LUAD的预后过程中可能起关键作用，可能是潜在的治疗靶标。但是，这些预测还需要通过一系列实验加以验证。本研究的结果为LUAD的潜在生物学机制和治疗靶标提供了一些有用的信息和方向。