中国医科大学学报  2021, Vol. 50 Issue (9): 814-819

文章信息

伍海军, 吴静澜, 杨欣, 杨华, 潘政, 陈永顺
WU Haijun, WU Jinglan, YANG Xin, YANG Hua, PAN Zheng, CHEN Yongshun
基于网络药理学三七治疗缺血性脑卒中的作用机制研究
Potential mechanism of Sanqi in the treatment of ischemic stroke based on network pharmacology
中国医科大学学报, 2021, 50(9): 814-819
Journal of China Medical University, 2021, 50(9): 814-819

文章历史

收稿日期：2020-11-30
网络出版时间：2021-09-09 13:18
 Abstract              PDF               Figures               Tables
引用本文
伍海军, 吴静澜, 杨欣, 杨华, 潘政, 陈永顺. 基于网络药理学三七治疗缺血性脑卒中的作用机制研究[J]. 中国医科大学学报, 2021, 50(9): 814-819.
WU Haijun, WU Jinglan, YANG Xin, YANG Hua, PAN Zheng, CHEN Yongshun. Potential mechanism of Sanqi in the treatment of ischemic stroke based on network pharmacology[J]. Journal of China Medical University, 2021, 50(9): 814-819.
基于网络药理学三七治疗缺血性脑卒中的作用机制研究
伍海军1 , 吴静澜2 , 杨欣2 , 杨华1 , 潘政1 , 陈永顺1     
1. 贵州中医药大学第一附院医院神经外科, 贵阳 550001;
2. 贵州中医药大学药学院中药学教研室, 贵阳 550025
收稿日期：2020-11-30；网络出版时间：2021-09-09 13:18
基金项目：贵州省科技合作计划（黔科合基础[2019]1028）
作者简介：伍海军(1981-), 男, 副主任医师, 硕士.
通信作者：杨欣，E-mail：5591609@qq.com.
摘要：目的 探讨三七治疗缺血性脑卒中的有效成分、靶点及通路，以及可能的分子机制。方法 通过中药系统药理学分析平台获取三七活性成分；利用UniProtKB数据库、DisGeNET数据库筛选出三七治疗缺血性脑卒中关联的作用靶标；采用Cytoscape 3.6.0软件建立三七有效成分-缺血性脑卒中作用靶标网络；通过DAVID数据库构建作用靶标之间互相作用网络，获得京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路、基因肿瘤学（GO）分类富集分析结果，建立有效成分-作用靶标-信号通路网络。结果 筛选出了三七治疗缺血性脑卒中5个有效成分（豆甾醇、β-谷固醇、人参皂苷rh2、槲皮素、三七皂苷r1），141种交集靶标，5个核心靶标（白细胞介素-6、蛋白激酶B、c-JUN蛋白、肝磷脂结合表皮生长因子、血管内皮生长因子A）。低氧诱导因子-1通路、磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路、丝裂原活化蛋白激酶通路是三七治疗缺血性脑卒中的重要信号通路。结论 三七通过自身有效成分作用多个靶标基因治疗缺血性脑卒中，其作用机制可能是通过信号通路获得非常复杂的网络药理调节完成的。
关键词：三七    缺血性脑卒中    网络药理学    作用机制    
Potential mechanism of Sanqi in the treatment of ischemic stroke based on network pharmacology
WU Haijun1 , WU Jinglan2 , YANG Xin2 , YANG Hua1 , PAN Zheng1 , CHEN Yongshun1     
1. Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, China;
2. Department of Traditional Chinese Medicine, Pharmacy College, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China
Abstract: Objective To study the effective components, targets, and pathways of Sanqi in the treatment of ischemic stroke, and to explore its possible molecular mechanism. Methods The active ingredients of Sanqi were obtained by using a network pharmacology and Chinese medicine systematic pharmacology analysis platform. UniProtKB database, DisGeNET database, and Excel 2010 software were used to screen out the associated targets of Sanqi in the treatment of ischemic stroke. Cytoscape 3.6.0 software was used to establish the active component-ischemic stroke target network of Sanqi. We used the Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) to build a target interaction between the networks.We also performed Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis and gene ontology (GO) classification. We investigated the role of notoginseng in the treatment of ischemic cerebral apoplexy, mainly the signaling pathways and the related molecular functions, and at the same time, established an "active ingredient-target-signaling pathway" network. Results Five effective components (stigmasterol, beta-sitosterol, ginsenoside rh2, quercetin, and notoginsenoside r1) of Sanqi acting on ischemic stroke and 41 intersection targets were obtained by the above method. There were five core targets: interleukin-6 (IL-6), protein kinase B (AKT), C-Jun protein (C-Jun), heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF), and vascular endothelial growth factor A (VEGFA), and these are mainly used to treat ischemic stroke by regulating and controlling signaling pathways and changing protein binding. Conclusion Sanqi, an important drug in the treatment of ischemic stroke, can have multiple effects by acting on multiple targets, and can also obtain very complex pharmacological regulatory effects through the signaling pathway.
Keywords: Sanqi    cerebral ischemic stroke    network pharmacology    mechanism of action    

研究[1-2]显示，脑卒中发病率、致残率、死亡率均较高。其中缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke，CIS) 的发病率最高，占脑卒中60%~70% [3-4]。目前CIS主要采用中西医药物治疗，目的是修复血管内皮损伤，避免血小板之间聚集和黏附，并通过抗凝、调节纤溶系统平衡等机制改善脑循环，保护脑神经元。研究[4-5]证实，CIS不论是急性期还是恢复期采用中药治疗都能显著改善神经功能。

三七总皂苷通过改善能量代谢障碍，抑制血小板聚集、降低血小板黏附等作用减少细胞损伤[5]。目前，对三七治疗CIS方面研究大多在单体和复方上，而三七成分复杂，治疗作用的相关机制尚不明确。网络药理学是依托系统生物学，通过使用生物网络技术来阐述“药物-基因-靶点-疾病”之间复杂关联的一门学科[6]。本研究利用网络药理学探讨三七治疗CIS有效化学成分、靶标基因及相关的信号通路，为阐明三七治疗CIS的作用机制提供依据。

1 材料与方法 1.1 三七活性成分获取

通过中药系统药理学分析平台(http://lsp.nwu.edu.cn) 检索获取三七化学成分相关信息，三七活性成分纳入标准：(1) 口服吸收度(oral bioavailability，OB) >30%；(2) 类药(drug-likeness，DL) >0.18 [5-6]。

1.2 靶标基因获取

1.2.1 三七活性成分靶标基因获取

采用中药系统药理学分析平台(http://lsp.nwu.edu.cn) 获取三七活性成分靶标蛋白。通过UniProtKB数据库(https://www.uniprot.org/) 检索活性成分获得靶标蛋白名称，同时获取靶标蛋白基因及其通用蛋白质知识库(universal protein knowledge base，UNIPROTKB) 的通用蛋白标识(universal protein identification，UPID)。

1.2.2 CIS靶标基因获取

以“ischemic stroke”为关键词，检索DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/) 来获取CIS靶标基因。

1.2.3 三七治疗CIS的靶标基因获取

采用Excel 2010筛选出三七活性成分靶标基因和CIS靶标基因的交集基因作为三七治疗CIS的靶标基因(简称为作用靶标基因)，同时筛选出该基因对应的UPID。

1.3 有效成分-作用靶标基因网络建立

将作用靶标基因和三七活性成分相关关系文件导入Cytoscape 3.6.0软件系统中分析，构建有效成分-作用靶标基因网络。

1.4 重要信号通路和分子功能获取

将作用靶标基因导入the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery (DAVID) 数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，获得京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG) 通路、基因肿瘤学(gene oncology，GO) 分类富集分析结果。选取P < 0.001的分子功能以及信号通路，从中筛选出排名前20位的分子功能以及信号通路。

1.5 有效成分-作用靶标-信号通路的网络构建

通过DAVID数据库，选择富集三七治疗CIS有效成分-CIS靶标基因的作用靶标，与作用靶标基因比较来筛选出交集靶标。将这些交集靶标与有效成分-作用靶标基因网络进行配对，然后将匹配的关系文件导入Cytoscape 3.6.0软件系统中，构建有效成分-作用靶标-信号通路网络关系图。

2 结果 2.1 三七活性成分的筛选结果

结果显示，共获得三七化学成分119个，符合本研究纳入标准的活性成分5个，包括β-谷固醇、豆甾醇、槲皮素、人参皂苷rh2、三七皂苷r1，见表 1。

表 1 三七活性成分 Tab.1 Active components of Sanqi
Order Active ingredient 0B (%) DL
1 Stigmasterol 43.83 0.76
2 Beta-sitosterol 36.91 0.75
3 Ginsenoside rh2 36.32 0.56
4 Quercetin 46.43 0.28
5 Notoginsenoside r1 42.00 0.19
OB, oral bioavailability; DL, drug-likeness.
表选项

2.2 作用靶标基因的筛选结果

把5个活性成分在DRAR-CPI服务器中反向对接得到147个靶标基因(Z < -0.5)；将上述靶标基因与GeneCards和DisGeNET数据库中的CIS标靶基因进行比对，获得96个作用靶标基因，见表 2。

表 2 作用靶标基因筛选结果 Tab.2 Screening results of the target genes
Order Target genes UPID Order Target genes UPID Order Target genes UPID
1 ADCYAP1 P185O9 33 IL1B P01584 65 PONI P27169
2 AKT P31749 34 IL2 P60568 66 POR P16435
3 CCNBI P14635 35 IL6 P05231 67 PRARA Q07869
4 CCND1 P24385 36 INSR P06213 68 PPARD QO3I81
5 CHRM1 Pl1229 37 IRF1 P10914 69 PPARG P37231
6 CHRM2 P08172 38 c-JUN P05412 70 PRKACA P17612
7 CHRM3 P20309 39 KCNH2 Q12809 71 PRKCA PI7252
8 CHUK O15111 40 LTA4H P09960 72 PRKCB P05771
9 CXCL8 P10145 41 MAP2 P11137 73 PRSS1 P07477
10 E2F1 Q010W 42 MGAM O43451 74 PTEN P60484
11 E2F2 QI42O9 43 MMP1 P03956 75 PTGSI P23219
12 HB-EGF P01133 44 MMP3 P08254 76 PTGS2 P35354
13 EGFR POO533 45 MMP9 P14780 77 RAF1 P04049
14 ELK1 P19419 46 MPO P05164 78 RSSA1 P20936
15 ERBB2 PO4626 47 MYC P01106 79 RB1 PO6400
16 ERBB3 P21860 48 NCF1 PI4598 80 RELA Q04206
17 F2 P00734 49 NCOA1 Q15788 81 RUNX2 Q13950
18 F3 P13726 50 NCOA2 Q15596 82 RXRA P19793
19 FOS P01100 51 NFE2L2 Q16236 83 SCN5A Q14524
20 GJA1 PI7302 52 NFKBIA P25963 84 SELE P16581
21 GSIVl P09488 53 NOS3 P29474 85 SLC2A4 P14672
22 GSTM2 P28161 54 NQ01 P15559 86 SLC6A4 P31645
23 GSTP1 P09211 55 NR1/2 O75469 87 S0D1 P00441
24 HIF-1a QI6665 56 NR1/3 Q14994 88 SPP1 P10451
25 HK2 P52789 57 NR3C2 P08235 89 STATI P42224
26 HMOX1 P09601 58 ODC1 Pl1926 90 TGFB1 P01I37
27 HSF1 Q006I3 59 OPRM1 P35372 91 THBD P07204
28 HSP90AB1 P08238 60 PARP1 P09874 92 TNF P01375
29 ICAMI P05362 61 PGR P06401 93 VCAM1 P19320
30 IFNG P01579 62 PIK3CG P48736 94 VEGFA P15692
31 IGF2 P01344 63 PLAT P00750 95 XDH P47989
32 IL10 P22301 64 PLAU P00749 96 ILIA P01583
UPID, universal protein identification.
表选项

2.3 有效成分-作用靶标基因的网络构建结果

结果显示，5个有效成分和96个作用靶标基因的节点数为101，134条边线表示两者之间存在134种关系，其中83个作用靶标基因与槲皮素相互有作用关系。说明三七的有效成分可以对应相同或不同的作用靶标基因，可见三七治疗CIS具有多成分、多靶标的特点。见图 1。

图 1 有效成分-作用靶标基因网络 Fig.1 The network of the effective components-target gene
图选项

2.4 核心靶标的筛选结果

通过String数据库绘制出靶标的相互作用网络图，边线1 187条、节点96个，见图 2。使用Network Analyzer工具计算得到靶标连接度结果显示，连接度最高的5个靶标是蛋白激酶B (protein kinase B，AKT)、白细胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)、血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、c-JUN蛋白(C-jun protein，c-JUN)、肝磷脂结合表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF)，因此认为这5个靶标就是核心靶标。

图 2 作用靶标的相互作用网络 Fig.2 The interaction network of the targets
图选项

2.5 重要信号通路和分子功能的筛选结果

KEGG通路和GO分类富集分析结果显示，前20位信号通路或分子功能见表 3。经过查阅文献[7-8]，认为低氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor -1，HIF-1)、磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK) 是三七治疗CIS的重要信号通路。

表 3 作用靶标的KEGG通路富集分析结果 Tab.3 Enrichment analysis results of the target by the KEGG pathway
Signal pathway or molecular function Number of targets Total number of targets P
PI3K/AKT signaling pathway 21 345 9.72×10-9
HTLV-Ⅰ infection 20 254 3.44×10-10
MAPK signaling pathway 18 253 1.70×10-8
Influenza A 17 174 4.99×10-16
HIF-Ⅰ signaling pathway 16 96 7.94×l0-13
TNF signaling pathway 16 107 4.09×10-12
MicroRNAs in cancer 16 286 3.15×10-6
Pancreatic cancer 15 65 4.59×10-14
Prostate cancer 15 88 3.81×10-12
Osteoclast differentiation 15 131 9.31×10-16
Leishmaniasis 14 71 3.65×10-12
FoxO signaling pathway 14 134 1.29×10-8
Focal adhesion 14 206 2.02×10-6
Ras signaling pathway 14 226 5.65×10-6
Bladder cancer 13 41 5.97×10-14
Non-small cell lung canter 13 56 3.61×10-12
Small cell lung cancer 13 85 6.28×10-16
Rheumatoid arthritis 13 88 9.50×10-10
Toll-like receptor signaling pathway 13 106 8.43×10-9
Thyroid honmone signaling pathway 13 115 2.15×10-8
表选项

2.6 有效成分-作用靶标-信号通路网络构建结果

结果显示，有效成分-作用靶标-信号通路网络共49个节点，三七治疗CIS的机制为5个有效成分作用于41个作用靶标，调控3个重要信号通路来发挥保护缺血损伤、抗炎等作用。见图 3。

图 3 有效成分-作用靶标-信号通路网络 Fig.3 The network about effective component-target-signaling pathway
图选项

3 讨论

研究[7]显示，中药三七具有通脉行瘀以及止血效果。三七通过改善内皮功能显著抑制血小板的活化作用，从而降低血液黏度，有效预防血栓的形成。已有研究[8]证明三七具有抗氧化、抗粥样硬化斑块形成以及抗炎的效果，治疗动脉粥样硬化疗效显著。

本研究从网络药理学出发构建了三七有效成份-作用靶标-信号通路网络图。结果显示，三七治疗CIS的5个有效成分作用于41个靶标基因，从而对CIS产生治疗效果。既往研究[9]指出脑细胞能量代谢紊乱和凋亡过程与槲皮素关系密切，槲皮素对脑血管疾病的治疗发挥着积极作用。本研究结果显示槲皮素作用于34个靶标基因，与以往研究结果一致。

张珊珊等[10]也证实了阻断PI3K/AKT信号转导通路，大鼠p-AKT1蛋白表达显著减少，显著影响血管再生。本研究对KEGG通路以及GO分类富集分析的结果显示，三七治疗CIS的机制为5个有效成分作用于41个作用靶标，调控HIF-1、PI3K/AKT、MAPK信号通路来发挥保护缺血损伤、抗炎等作用。可见三七治疗CIS的过程涉及多个活性成分、作用靶标及通路，与中药治疗疾病“多成分、多靶标、多通路”的作用特点相符合。

综上所述，三七通过自身有效成分作用多个靶标基因来治疗CIS，其作用机制可能是通过信号通路获得非常复杂的网络药理调节来完成的。本研究从理论层面研究了三七治疗CIS的作用机制，今后还需要相关细胞、分子实验及更多的临床研究进一步论证。

参考文献
[1]
高玲, 赵建军, 李艳艳, 等. 地龙治疗缺血性脑卒中作用机制的现代研究进展[J]. 时珍国医国药, 2019, 30(2): 196-198. DOI:10.3969/j.issn.1008-0805.2019.02.066
[2]
孙芳芳. 中医治疗方案对急性缺血性脑卒中患者神经功能缺损和致残结局的影响[J]. 中医临床研究, 2019, 11(14): 67-69. DOI:10.3969/j.issn.1674-7860.2019.14.026
[3]
张金燕, 宋军营, 陈颜嫣, 等. 脑脉舒康胶囊治疗合并高脂血症的缺血性脑卒中恢复期临床观察[J]. 中医临床研究, 2019, 11(5): 44-46. DOI:10.3969/j.issn.1674-7860.2019.05.017
[4]
周文瑾. 缺血性脑卒中中药治疗进展[J]. 中医学报, 2019, 34(1): 60-65. DOI:10.16368/j.issn.1674-8999.2019.01.014
[5]
郭瑞友, 韩萍, 侯荣耀, 等. 三七粉治疗颅内动脉粥样硬化性狭窄缺血性卒中患者的疗效观察[J]. 中国中西医结合杂志, 2018, 38(12): 1518-1520. DOI:10.7661/j.cjim.20181025.313
[6]
邢心睿, 吕狄亚, 柴逸峰, 等. 网络药理学在中药作用机制中的研究进展[J]. 药学实践杂志, 2018, 36(2): 97-102. DOI:10.3969/j.issn.1006-0111.2018.02.001
[7]
殷捷鸿. 中药三七抗衰老作用研究进展[J]. 中国老年学杂志, 2016, 36(12): 3060-3061. DOI:10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.110
[8]
何雪峰, 李晓辉, 李淑惠, 等. 三七总皂苷对家兔实验性动脉粥样硬化的预防作用[J]. 中国药房, 2007, 18(6): 408-410. DOI:10.3969/j.issn.1001-0408.2007.06.003
[9]
任锟, 李彦杰, 邢若星, 等. 槲皮素对非对称性二甲基精氨酸诱导损伤的脑血管内皮细胞的保护作用及其机制研究[J]. 中国脑血管病杂志, 2019, 16(2): 82-88. DOI:10.3969/j.issn.1672-5921.2019.02.005
[10]
张珊珊, 罗勇, 武磊. PI3K/AKT通路在电针促进局灶脑缺血再灌注大鼠脑内血管再生中的作用[J]. 第三军医大学学报, 2010, 32(23): 2488-2491. DOI:10.16016/j.1000-5404.2010.23.002