2021, Vol. 50文章信息
- 朱英会, 仲伟俍, 王志坚, 仲涛, 田康
- ZHU Yinghui, ZHONG Weiliang, WANG Zhijian, ZHONG Tao, TIAN Kang
- miR-149-5p通过HMGA2调控骨肉瘤细胞迁移
- miR-149-5p regulates the migration of osteosarcoma cells through HMGA2
- 中国医科大学学报, 2021, 50(6): 521-525
- Journal of China Medical University, 2021, 50(6): 521-525
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文章历史
- 收稿日期：2020-12-07
- 网络出版时间：2021-05-26 16:28
引用本文 |
2. 大连医科大学附属第一医院骨科, 辽宁 大连 116011
2. Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, China
骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤之一，主要发生在儿童和青少年，具有高度异质性，可产生不成熟的骨和类骨结构[1]。20世纪70年代，截肢是OS唯一的干预手段，患者5年生存率低于20%。化疗显著提高了患者的预期寿命，目前患者的5年生存率为65%~70%[2-3]。自20世纪90年代以来，患者生存率并未明显提高[2-3]。因此，更好地了解促进OS发生、发展的生物学过程和关键机制，对于提高OS患者的治疗效果和预后至关重要。
微RNA（microRNA，miRNA）是一类非编码RNA，其最常见的功能是通过结合mRNA从而负调控靶基因的表达，在细胞增殖和侵袭等生物学过程中发挥关键作用[4-5]。miR-149-5p是miRNA的一种，已经发现其在乳腺癌和胶质瘤中表达下调，并与肿瘤转移、复发相关[4]。在神经母细胞瘤中，miR-149-5p通过抑制Akt1和E2F1的表达，诱导细胞凋亡[6]。研究[7]发现，miR-149-5p在OS中表达下调，且与肿瘤大小和预后不良相关。但其在OS中的具体调控机制尚不明确，相关研究较少。
高迁移率族蛋白A2（high mobility group protein A2，HMGA2）是HMGA蛋白家族的成员，通过直接结合基因启动子和增强子区域的A/T富集的DNA序列，参与染色质结构的调控[8]。它在多种肿瘤中高表达，并调控多种肿瘤的生物学过程。研究[9]发现，其受lncVPS9D1-AS1的调控，促进结肠癌生长。此外，其还受miR-142-3p的调节，参与OS的生长、转移过程[10]。但其调控机制和过程仍存在许多未知，其可能与miR-142-3p具有相似的机制，参与OS的进展。本研究探讨了miR-149-5p与HMGA2之间的调控关系及其对OS细胞迁移能力的影响。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器OS细胞（Saos2、MG63、U2OS和HOS）和hFOB1.19细胞购自中国科学院细胞库。胎牛血清购自美国Gibco公司，基础培养基购自中国HyClone公司。miR-149-5p过表达序列及阴性对照（negative control，NC）、HMGA2过表达质粒由上海吉玛公司合成和提供。转染试剂购自中国Invitrogen公司，1%结晶紫染色液购自中国Solarbio公司，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒购自中国碧云天公司。HMGA2、β-actin抗体购自中国CST生物公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养MG63、HOS和U2OS细胞培养于α-MEM培养基（美国HyClone公司），添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素（中国赛默飞公司）。Saos2细胞培养于RPMI 1640培养基（美国HyClone公司），添加15%的胎牛血清（中国赛默飞公司）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素（中国赛默飞公司）。hFOB1.19细胞培养于改良的Eagle培养基（DMEM，中国赛默飞公司），添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。细胞置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。细胞生长融合度达到80%~90%左右进行1:2传代，传代后在相同条件下进行常规培养。
1.2.2 细胞转染实验使用Saos2细胞系，待细胞融合度达到50%~60%，使用转染试剂进行转染。转染过程使用转染试剂Lipofectamine 3000和P3000进行流程操作。
1.2.3 实时荧光定量PCR采用实时荧光定量PCR检测miR-149-5p的表达水平。使用TRIzol（中国碧云天公司），按照制造商的说明流程从每个细胞样品中提取总RNA。使用TaqMan MicroRNA（美国Applied Biosystems公司）逆转录试剂盒进行逆转录，按照试剂盒流程进行操作（日本TaKaRa公司），使用SYBR Green Master Mix试剂盒（日本TaKaRa公司），按照说明书进行目的RNA检测。miR-149-5p：正义链5’-GGCTCTGGCTCCGTGTCTT-3’，反义链5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。HMGA2：正义链5’-AGTCCCTCTAAAGCAGCTCA-3’，反义链5’-GTCCTCTTCGGCAGACTCTT-3’。U6：正义链5’-CAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3’，反义链5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTA TTC-3’。
1.2.4 Western blotting使用RIPA试剂（中国碧云天公司）提取细胞总蛋白并添加蛋白酶抑制剂。蛋白质经SDS-PAGE后转移到PVDF膜上（美国Bio-Rad公司）。PVDF膜进行5%牛血清白蛋白封闭，随后使用HMGA2、β-actin抗体（中国CST公司）4 ℃孵育（1: 1 000）过夜。第2天使用TBST清洗3次，每次5 min，然后进行二抗孵育（中国碧云天公司），孵育后TBST清洗3次，每次5 min。最后进行显色成像（Tanon-5200，日本佳能公司）。
1.2.5 Transwell实验细胞接种于Transwell小室上层，细胞密度为5×103/小室，并添加10%胎牛血清培养基进行培养，下室放同样浓度DMEM+胎牛血清培养基。细胞培养48 h后，使用多聚甲醛固定15 min，0.05%结晶紫染色20 min。随后拍照，进行细胞计数及细胞数量的统计学分析。其中PBS为空白对照组；mimic-miR-149-5p+vector组为miR-149-5p过表达模拟物加HMGA2过表达质粒空载体；HMGA2+mimic-NC组为HMGA2过表达质粒加miRNA过表达模拟物阴性对照序列；mimic-miR-149-5p+HMGA2组为miR-149-5p过表达模拟物加HMGA2过表达质粒。
1.2.6 生物信息学分析通过starbase（http://starbase.sysu.edu.cn）进行结合预测，该网站中包含有PITA和miRmap网站的结合信息。
1.3 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有实验至少进行3次，数据以x±s表示，组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 miR-149-5p和HMGA2在OS细胞中的表达情况为了探索miR-149-5p在OS中的作用，通过PCR检测和比较OS细胞（Saos2、MG63、U2OS和HOS）和hFOB1.19细胞中miR-149-5p和HMGA2的表达（图 1）。结果显示，与hFOB1.19细胞相比，miR-149-5p在Saos2、MG63和HOS细胞中低表达，HMGA2 mRNA在U2OS、Saos2、MG63和HOS细胞中高表达（P < 0.05）。Western blotting结果提示，HMGA2在OS细胞U2OS、Saos2、MG63和HOS中表达增加（图 2）。提示miR-149-5p可能参与OS的发生和进展，HMGA2是一个促癌基因。
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| A, miR-149-5p; B, HMGA2 mRNA. The hFOB1.19 cells were used as the control. * P < 0.05 vs hFOB1.19 cells. 图 1 PCR检测OS细胞中miR-149-5p和HMGA2 mRNA的表达情况 Fig.1 Expression of miR-149-5p and HMGA2 mRNA in different osteosarcoma cell lines detected using PCR |
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| 图 2 Western blotting检测OS细胞中HMGA2蛋白的表达 Fig.2 Expression of HMGA2 protein in different osteosarcoma cell lines detected using Western blotting |
2.2 miR-149-5p抑制OS细胞迁移
为进一步确认miR-149-5p在OS细胞恶性过程中的作用，通过转染构建过表达细胞系（Saos2），采用PCR检测细胞中miR-149-5p表达水平（图 3），证明过表达细胞系构建成功（P < 0.01）。采用CCK-8实验检测过表达miR-149-5p的Saos2细胞的迁移能力（图 4），结果显示，miR-149-5p过表达明显抑制了Saos2细胞的迁移能力，说明miR-149-5p参与OS细胞迁移能力的调节过程。
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| **P < 0.01 vs NC group. 图 3 PCR检测Saos2细胞中miR-149-5p过表达 Fig.3 miR-149-5p overexpression in Saos2 cells detected using PCR |
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| 图 4 Transwell实验检测过表达miR-149-5p的Saos2细胞的迁移能力×200 Fig.4 Migration of Saos2 cells after miR-149-5p overexpression detected using the Transwell assay ×200 |
2.3 miR-149-5p可调控HMGA2的表达
通过生物信息学网站starbase分析和预测miR-149-5p和HMGA2 mRNA的结合位点，结果发现，两者存在结合位点（图 5）。采用PCR检测miR-149-5p过表达细胞系Saos2中HMGA2 mRNA的表达，结果发现，过表达细胞系中HMGA2 mRNA表达明显下降（图 6A）（P < 0.05）。Western blotting结果显示，HMGA2蛋白表达水平也下降（图 6B）。这些结果说明miR-149-5p可调控细胞内HMGA2的表达水平。
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| 图 5 starBase网站预测miR-149-5p和HMGA2mRNA的结合位点 Fig.5 Binding sites of miR-149-5p and HMGA2 mRNA predicted using starBase |
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| A, expression of HMGA2 mRNA; B, expression of HMGA2 protein. NC, negative control. * P < 0.05 vs NC group. 图 6 过表达miR-149-5p后HMGA2mRNA和蛋白的表达情况 Fig.6 Expression of HMGA2 mRNA and protein after miR-149-5p overexpression |
2.4 miR-149-5p通过HMGA2调控OS细胞迁移
HMGA2受到miR-149-5p的调控，但miR-149-5p是否可通过HMGA2调控Saos2细胞的迁移能力，还需要进一步证明。因此，采用Transwell实验评估二者的关系及对细胞迁移能力的调节作用（图 7）。结果发现，过表达miR-149-5p可抑制HMGA2过表达引起的细胞迁移。
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| 图 7 miR-149-5p通过HMGA2调控OS细胞迁移×200 Fig.7 miR-149-5p regulates the migration of osteosarcoma cells through HMGA2 ×200 |
3 讨论
OS是最常见的恶性骨肿瘤，是一种侵袭性肿瘤，尽管原发性肿瘤的多药化疗和手术切除有了进展，但OS患者的5年总体生存率和复发率并未得到明显改善[11]。多种与关键信号转导通路相关的分子改变与OS病理生物学的多个过程有关，如增殖、侵袭、存活和转移[12]。因此，识别这些重要的分子靶点可能为OS的诊断和治疗提供新的方法。
最近的研究证实了miR-149-5p在包括癌症在内的多种疾病中具有不可或缺的作用。miR-149-5p在多种肿瘤中发挥重要作用，如在结直肠癌中其过表达抑制细胞迁移和侵袭[13]，在非小细胞肺癌中其抑制肿瘤细胞上皮间质转化过程，从而调节其转移能力[14]。胃癌中，miR-149-5p还可以抑制肿瘤干细胞群体的比例[15]。最近的研究[7]发现，miR-149-5p在OS肿瘤组织中低表达，并参与细胞生长能力调控过程，提示其可能是一个抑癌基因，但其具体调控机制尤其是对细胞迁移能力的调节机制尚不清楚。因此，本研究探讨了miR-149-5p在OS细胞迁移能力调控过程中的关键作用，通过PCR检测miR-149-5p在OS细胞中的表达，并通过PCR和Western blotting检测HMGA2在OS细胞中的表达。结果发现，miR-149-5p在OS细胞中表达下降，HMGA2 mRNA和蛋白表达增加。本研究发现，过表达miR-149-5p后Saos-2细胞迁移能力下降，通过生物信息学网站预测了miR-149-5p与HMGA2 mRNA的可能结合位点，最后通过Transwell实验证实了miR-149-5p通过HMGA2调控OS细胞的迁移。
综上所述，本研究通过PCR、Western blotting和Transwell实验检测OS细胞在不同条件下的迁移能力，发现了一个迁移调控关键基因miR-149-5p，其可能成为一个有效的肿瘤治疗靶点。
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