丹参酮是从中药丹参中提取的成分之一，但其不易通过肠道途径吸收，为此人们研制了丹参酮ⅡA磺酸钠(sodium tanshinone ⅡA sulfonate，STS)，以提高生物利用度^[1]。STS可诱导血管扩张，抑制炎症，预防动脉粥样硬化、心脏损伤和肥大等疾病，被认为是一种很有前途的天然心脏保护药物^[2]。砷是一种毒性强且分布广泛的金属元素，其被用于治疗肿瘤已有2 000多年的历史，对急性早幼粒细胞白血病有显著的治疗作用。然而，长期砷暴露可引起机体各系统疾病的发生，尤其是心血管系统，砷可引起包括心肌电生理改变、心肌坏死等在内的多种心脏损伤^[3-4]。现阶段，尚无很好的药物拮抗砷的心脏毒性作用。因此，本研究探讨了STS对亚砷酸钠(NaAsO₂) 诱导的大鼠H9c2心肌细胞损伤的影响，为防治砷的心脏毒性作用提供新的思路。

1 材料与方法 1.1 细胞与试剂

H9c2大鼠心肌细胞(上海复蒙基因生物科技有限公司)，DMEM培养基、DPBS、胎牛血清(加拿大维森特公司)，胰蛋白酶(美国Gibco Life公司)，NaAsO₂ (分析纯，美国Sigma公司)，STS (上海士峰生物科技有限公司)，CCK-8试剂盒(日本DOJINDO公司)，caspase 8检测试剂盒、caspase 3/7检测试剂盒(美国Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

在37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞传代时用0.25%的胰蛋白酶消化。

1.2.2 CCK-8法检测单独STS处理时的细胞活力

调整细胞密度为2×10³/孔，接种于96孔板中，贴壁后加入无血清DMEM饥饿培养12 h后进行后续实验。弃上清，分别用0、10、20、30、40、50、100 µmol/L的STS处理细胞12 h后，在450 nm处，采用CCK-8法检测细胞活力。

1.2.3 CCK-8法检测STS预处理6 h后加入NaAsO₂作用12 h后的细胞活力

细胞分为对照组、NaAsO₂组、10 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组、20 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组、30 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组、40 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组、50 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组，NaAsO₂浓度均为15 μmol/L，各浓度STS预处理6 h后再加入NaAsO₂作用12 h，在450 nm处，CCK-8法检测细胞活力。

1.2.4 CCK-8法检测STS预处理12 h后加入NaAsO₂作用24 h后的细胞活力

细胞分为对照组、NaAsO₂组、10 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组、20 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组、30 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组、40 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组、50 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组，NaAsO₂浓度均为10 μmol/L，各浓度STS预处理12 h后再加入NaAsO₂作用24 h，在450 nm处，CCK-8法检测细胞活力。

1.2.5 caspase 3/7实验检测STS与NaAsO₂联合处理后的凋亡情况

将细胞分为对照组、NaAsO₂组、STS组、NaAsO₂+STS组，STS浓度均为20 μmol/L，NaAsO₂浓度均为15 μmol/L。12 h后用caspase 3/7试剂盒检测细胞内caspase 3/7含量。

1.2.6 caspase 8实验检测STS预处理12 h后加入NaAsO₂作用24 h的凋亡情况

细胞分为对照组、NaAsO₂组、10 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组、20 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组、30 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组、40 μmol/L STS预处理+NaAsO₂组、50 μmol/L STS预处理+ NaAsO₂组，NaAsO₂浓度均为10 μmol/L，各浓度STS预处理12 h后再加入NaAsO₂作用24 h，按caspase 8试剂盒说明检测caspase 8活力。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，满足方差齐性时两两比较采用LSD-t法，不满足方差齐性时采用Dunnett’s T3法。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 单独STS处理对细胞活力的影响

与对照组(0 µmol/L STS) 相比，不同浓度的STS对细胞活力无明显影响，差异无统计学意义(P > 0.05)，见图 1。

2.2 STS预处理后6 h加入NaAsO₂作用12 h后对细胞活力的影响

与对照组相比，各浓度STS预处理+NaAsO₂组细胞活力无明显变化(P > 0.05)，NaAsO₂组细胞活力下降(P < 0.05)；与NaAsO₂组比，各浓度STS预处理+NaAsO₂组细胞活力均升高(P < 0.05)，见图 2。

2.3 STS预处理后12 h加入NaAsO₂作用24 h后对细胞活力的影响

与对照组相比，各浓度STS预处理+NaAsO₂组和NaAsO₂组细胞活力均降低(P < 0.05)；与NaAsO₂组相比，各浓度STS预处理+NaAsO₂组细胞活力均升高(P < 0.05)，见图 3。

2.4 STS与NaAsO₂联合处理后细胞内caspase 3/7含量的变化

STS与NaAsO₂联合作用12 h后，NaAsO₂组caspase3/7含量高于对照组、STS组、NaAsO₂+STS组，差异有统计学意义(P < 0.05)，见图 4。

2.5 STS预处理后加入NaAsO₂对细胞凋亡的影响

STS预处理12 h后加入NaAsO₂作用24 h，NaAsO₂组caspase 8含量低于其他组，但差异无统计学意义(P > 0.05)，见图 5。

3 讨论

砷是一种很古老的有毒金属，普遍存在于环境中，其中亚砷酸盐的毒性最大，多个国家人民受其所害，中国也在其中。砷已被证明会引起许多心血管疾病，并可引起心肌细胞损伤和心肌细胞凋亡^[5-6]。STS具有抗氧化、抗凋亡等多种药理活性，已被中国药品监督管理局批准用于治疗心血管疾病^[7-8]，但是NaAsO₂中毒与丹参酮ⅡA联合作用并未见报道。本研究从细胞水平探讨STS对NaAsO₂诱导的心肌损伤的影响，CCK-8法检测结果表明，一定浓度的STS (0~50 μmol/L及100 μmol/L) 对H9c2细胞无细胞毒性作用。此外，STS预处理能有效地逆转NaAsO₂引起的细胞活力下降，减少NaAsO₂诱导的H9c2心肌细胞凋亡。

caspase是一类与细胞凋亡相关的蛋白酶家族，分为起始型和执行型，两者在外来蛋白信号的作用下被依次激活后引起程序性细胞死亡。起始型caspase 8是细胞凋亡、坏死的分子开关，caspase 3和caspase 7是执行细胞凋亡的相关因子，其过量表达已被证明能降低心肌收缩力，在许多病理疾病中导致心功能不全^[9-12]。PRASANNA等^[13]证实NaAsO₂可上调大鼠心脏组织中的caspase 3，本研究结果与其一致。此外，本研究中STS可抑制细胞中NaAsO₂处理组caspase 3/7表达，这也提示STS在一定程度上可能会保护心肌细胞免受NaAsO₂导致的凋亡作用。本研究中STS能抑制caspase 3表达水平增加，而caspase 8的表达水平无显著变化。已有研究^[14]证明，Bax/Bcl-2、caspase 3和caspase 9是线粒体凋亡途径中的重要分子，而caspase 8和caspase 12分别是死亡受体信号途径和内质网凋亡途径中的关键因子，故STS的抗凋亡作用可能是通过线粒体依赖的凋亡途径介导的。

总之，STS可以逆转NaAsO₂诱导的细胞活力下降和凋亡，为STS对NaAsO₂诱导的H9c2细胞凋亡的抑制作用提供了一种可行的分子解释，为防治NaAsO₂诱导的心力衰竭提供了一个新思路。需要进行进一步的研究，阐明STS对心肌细胞凋亡保护作用的确切机制。