肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC) 是高发病率的恶性肿瘤，具有高死亡率和转移率的特点。HCC是原发性肝癌的一种高度侵袭性亚型，具有转移潜力和低生存率，占所有原发性肝癌的75%~85%^[1-2]。HCC的早期症状和生物标志物通常难以识别，因此，很少能在早期确诊，而确诊时往往已经处于晚期阶段，从而降低了治愈率。目前，HCC的治疗方法主要包括手术、化学治疗、放射治疗和分子靶向治疗^[3-4]。即使经过综合治疗后，HCC患者的5年生存率仍低于60%^[5-6]。在分子靶向治疗的研究中，环状RNA (circular RNA，circRNA) 对肝癌细胞代谢的影响是目前的研究热点之一^[7]。circRNA是一类非编码RNA (non-coding RNA，ncRNA)，具有可与信使RNA (message RNA，mRNA) 结合的微小RNA (microRNA，miRNA) 响应元件，从而可促进miRNA调控基因的能力。作为miRNA的分子海绵，circRNA能抑制miRNA靶基因，影响转录后调控^[8-11]。既往研究表明，circRNA在多种肿瘤中异常表达。有研究^[12]显示，circSEC31A (hsa_circ_0001421) 在非小细胞肺癌细胞高表达，并可通过调控miR-376a影响非小细胞肺癌细胞的恶性生物学行为。但circRNA在肝癌中的表达和功能迄今尚无报道。

肿瘤细胞的异常快速增殖伴随着细胞代谢异常旺盛。肝癌细胞糖代谢较正常细胞旺盛。即使在有氧情况下，肝癌细胞也依赖糖酵解维持快速生长的需求，称为瓦伯格效应。大量研究^[13-15]证实，抑制肝癌细胞有氧糖酵解能够抑制肿瘤细胞生长。本研究拟探讨circSEC31A在HCC组织和肝癌细胞HepG2中的表达水平，以及外源性敲减circSEC31A对HepG2细胞增殖和有氧糖酵解的影响，旨在为HCC的诊断和治疗提供新的靶点。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 肝癌组织和细胞

人HCC组织15例均取材自2020年6月至12月中国医科大学附属盛京医院普通外科肝癌切除术中。用于阴性对照的肝脏组织7例取材自同期腹部外伤肝脏破裂急诊减压组织。所有组织离体后立即置入液氮中冻存。本研究已获得中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准。所有患者均已签署知情同意书。正常肝细胞株WRL68和肝癌细胞株HepG2购自中科院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂

Trizol试剂、lipofectamine3000、Opti-MEM^®Ⅰ (美国Invitrogen公司)；DMEM高糖培养基(美国Corning公司)；胎牛血清、RNase R (美国ThermoFisher公司)；DMSO (美国Sigma公司)；TaqMan^® MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan^® Universal Master Mix Ⅱ (美国Ambion公司)；circBACH2引物设计及合成(中国上海闪晶公司)；circBACH2沉默质粒(苏州吉玛公司)；EdU Kit (广州锐博科技公司)；细胞能量代谢实时测定仪/生物能量代谢测定仪XF96 (美国海马公司)；丙酮酸激酶活性检测试剂盒(美国Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和实时荧光定量PCR

应用Trizol试剂提取肝癌组织和HepG2细胞总RNA，加入RNase R降解线状RNA，RNA样品稀释后测定浓度。应用Taqman^® MicroRNA Reverse Transcription Kit反转录RNA，应用TaqMan^® Universal Master Mix Ⅱ和TaqMan MicroRNA Assay (circSEC31A和GAPDH) 行实时荧光定量PCR。PCR反应体系20 μL包含TaqMan Universal Master Mix Ⅱ和Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit，Mix 10 μL、正向及反向引物各0.4 μL、C×R 0.2 μL、cDNA 2 μL及无核酸酶水7 μL。反应条件: 预变性95 ℃ 2 min，95 ℃变性15 s，退火60 ℃ 1 min，40个循环。circSEC31A上游引物序列为5’-CCAGTGAGAGCCTTGGATGT-3’，下游引物序列为5’-TGAGCAGATGTTCCTGTTGC-3’；GAPDH上游引物序列为5’- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物序列为5’GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。应用7500Fast Real-TimePCR System测定Ct值，以GAPDH为内参照，以2^-ΔΔCt表示circRNA的相对表达量。

1.2.2 细胞转染及分组

24孔板内接种HepG2细胞(5×10⁴/孔)，待细胞生长至70% 融合时，按照lipofectamine3000说明书，分别应用circSEC31A沉默质粒载体以及空对照转染HepG2细胞，用0.4 mg/mL G418筛选细胞。4周后，筛选出稳定转染的细胞系，分为空白对照组、转染circSEC31A沉默质粒空白对照(sh-NC) 组和转染circSEC31A沉默质粒(sh-circSEC31A) 组。

1.2.3 EdU法检测细胞增殖

制备HepG2细胞悬液，接种于96孔板(1×10⁴/孔)。培养24 h后，各组终止反应，弃培养液。加入100 μL事先配制的EdU溶液，孵育4 h。荧光显微镜下观察计数，绿色荧光为阳性染色细胞。

1.2.4 细胞代谢检测

应用H-2DG试剂盒检测HepG2细胞的葡萄糖摄取量，无血清培养法检测乳酸产量，细胞能量代谢实时测定仪检测细胞氧耗量，糖酵解通量分析检测细胞糖酵解速率。

1.2.5 Western blotting

利用蛋白提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司) 提取Hep2G细胞总蛋白，定量后行SDS-PAGE分离目的蛋白，转移至PVDF膜，封闭2 h，加入有氧糖酵解相关蛋白缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha subunit，HIF-1α) 一抗(美国Abcam公司，稀释比例1∶200) 4 ℃过夜，加入二抗(美国Santa公司，1∶500) 室温孵育1 h，显色后GelDoc XR Biorad凝胶成像系统(美国Bio-rad公司) 下扫描拍照。以GAPDH (抗体购自美国Santa公司) 为内参。采用Image J软件分析每个样本蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值之比，以其比值作为目的蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。数据采用x±s表示，组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 circBACH2在HCC组织和HepG2细胞中的表达

实时荧光定量PCR检测结果显示，与正常对照肝组织(1.006±0.118) 和正常肝细胞WRL68 (1.000±0.025) 相比，circSEC31A在HCC组织(5.039±0.449) 及HepG2细胞(4.002±0.313) 中的表达水平均显著上调(均P < 0.01)，见图 1。

2.2 沉默circSEC31A抑制HepG2细胞的增殖

EdU染色检测结果显示，与空白对照组相比，sh-NC组细胞增殖能力无显著变化。与sh-NC组相比，sh-circSEC31A组的细胞增殖能力显著下降(P < 0.01)，见图 2。提示沉默circSEC31A能显著抑制HepG2细胞的增殖。

2.3 沉默circSEC31A抑制HepG2细胞的有氧糖酵解

葡萄糖摄取实验结果显示，与空白对照组相比，sh-NC组细胞有氧糖酵解水平无显著变化。与sh-NC组相比，sh-circSEC31A组的细胞有氧糖酵解水平显著降低(P < 0.01)，见图 3。提示沉默circSEC31A能显著抑制HepG2细胞的有氧糖酵解。

2.4 沉默circSEC31A抑制有氧糖酵解相关蛋白HIF-1α的表达

Western blotting结果显示，sh-NC组与空白对照组HIF-1α表达水平无统计学差异；与sh-NC组相比，sh-circSEC31A组HIF-1α蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义(P < 0.01)，见图 4。提示沉默circSEC31A能显著抑制有氧糖酵解相关蛋白HIF-1α的表达。

3 讨论

肝癌是最常见的恶性原发性肿瘤，尽管手术方式不断完善，放化疗手段不断创新，其5年生存率仍低于60%。因此，探讨肝癌发生发展的机制非常重要。近年来的研究提示ncRNA调控网络在肝癌的发生发展中发挥至关重要的作用。

人类基因组的大部分并不编码蛋白质，但是可以剪切成ncRNA，例如miRNA、长链非编码RNA或circRNA。circRNA是封闭的RNA，起源于pre-RNA的反向剪接，因此缺少3’和5’结构。它是一种内源性RNA，在真核细胞中很常见，具有基因调控功能。大多数circRNA位于细胞质中，少数位于细胞核中。circRNA非常稳定，不易被RNase R降解。随着高通量测序和生物信息学技术的发展，circRNA在越来越多的肿瘤中被发现。circRNA-9119能通过下调miR-26a//JAK1/STAT3通路的活性抑制肝癌细胞的凋亡^[11]；circPIP5K1A可以通过海绵吸附miR-671-5p，激活PI3K-AKT信号通路，从而促进胃癌的进展^[16]。circRNA具有稳定表达的特点，半衰期长，在多种肿瘤中呈特异性表达，因此，circRNA已成为一种新型的肿瘤生物标志物，用于肿瘤的早期诊断和筛查^[17]。

本研究结果显示，circSEC31A在HCC组织和HepG2细胞中高表达。EdU法检测结果显示，将circSEC31A的沉默质粒转染入HepG2细胞后，HepG2细胞的增殖水平显著下降，表明沉默circSEC31A表达可抑制HepG2细胞的增殖能力。同时，本研究结果还证实了沉默circSEC31A能够降低HepG2细胞的有氧糖酵解水平，并显著下调有氧糖酵解相关蛋白HIF-1α的表达。研究显示，肿瘤细胞有氧糖酵解的发生均伴随着HIF-1α表达水平的上调，然而，本研究中circSEC31A调控HIF-1α的具体机制仍有待进一步研究。

综上所述，本研究证实了circSEC31A在HCC组织和HepG2细胞中表达上调，在HepG2细胞中发挥促癌基因的作用，因此，circSEC31A有可能成为未来肝癌精准治疗的基因新靶点。circRNA调控肿瘤细胞生物学行为的机制十分复杂，circSEC31A通过何种方式和途径影响肝癌细胞的恶性生物学行为的机制有待深入探索。