宫颈癌是全球女性中常见的恶性肿瘤，人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持续性感染在宫颈癌的发生、发展中发挥关键作用^[1]。目前可鉴定出的HPV类型高达200多种，根据其致癌潜力将HPV分为高危型HPV和低危型HPV。HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52和HPV58是全世界范围内最常见的高危型HPV。2018年2月至2019年3月间，在中国医科大学附属盛京医院接受HPV检测的患者中，HPV31阳性率约为1.146%。

E6和E7基因编码的早期蛋白是目前高危型HPV研究中最多的癌蛋白。它们是参与人类上皮细胞永生化和转化的关键癌蛋白，并通过与多种宿主蛋白相互作用而发挥作用^[2]。因此，存在于E6和E7基因上的突变很可能导致氨基酸序列突变，进而改变蛋白质的结构和功能，从而影响宿主的免疫应答情况^[3-4]。CHAGAS等^[5]对巴西东北部HPV31 E6和E7基因多态性进行研究，发现非同义突变C285T、A297G、A475G、C520T、C626T、G695A、A743G、C737G可以导致极性、亲水性电位和氨基酸侧链发生变化，进而可能改变癌蛋白折叠，从而影响病毒的致病性。ZHANG等^[6]对四川地区HPV31 E6和E7基因多态性进行研究，也验证了这些非同义突变的存在。但是，有关中国东北地区HPV31 E6和E7基因多态性的研究较少。因此，本研究对中国东北地区HPV31 E6和E7基因多态性进行了相关研究。

1 材料与方法 1.1 标本采集

收集2018年2月至2019年3月在中国医科大学附属盛京医院进行HPV检测、结果呈HPV31阳性的脱落宫颈细胞DNA标本。共采集到合格DNA标本204例，来源患者年龄为18~69岁，中位年龄41岁。标本采集前已取得患者知情同意，本研究承诺保护患者隐私。

1.2 PCR扩增

1.2.1 引物设计

应用Primer 5.0生物信息学软件，以J04353.1为参考序列设计巢氏PCR引物。引物1，正义5’-TAAACTGCCAAGGTTGTG-3’，反义5’-TGTTCCTCCGCTTCCTGT-3’；引物2，正义5’-AAAAGTAGGGAGTGACCG-3’，反义5’-TTCGTCCTCTGAAATGTTG-3’。

1.2.2 扩增体系

巢氏PCR第一步扩增体系25 μL（DNA样品3.0 μL，GoTaq^® Green Master Mix，2×，12.5 μL，引物F1和R1各1.0 μL，无核酸酶水7.5 μL）；第二步扩增体系50 μL（第一步25 μL体系所得扩增产物2.0 μL，GoTaq^® Green Master Mix，2×，25 μL，引物F2和R2各2.0 μL，无核酸酶水19.0 μL）。

1.2.3 扩增条件

95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，重复30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.3 扩增产物测序

将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将合格产物送至美国Invitrogen公司北京分公司测序。

1.4 序列比对和系统发育树的构建

应用MegaX软件将测序得到的结果与参考序列J04353.1进行序列比对分析，找出突变位点。将比对结果使用MegaX软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树。为确保实验数据准确性，PCR扩增和序列分析至少重复2次。

1.5 选择压力分析

应用生物信息学软件包PAML4.9中的codeml程序估测HPV31 E6和E7序列中的阳性选择位点。该程序使用NEI等^[7]的方法执行似然比测试，以推断编码区的非同义和同义核苷酸差异。HPV31 E6和E7蛋白序列应用MegaX进行比对。

1.6 蛋白质二级结构预测

应用PSIPred server（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）预测参考序列的二级结构，随后对突变位点所在的二级结构进行判断。

1.7 表位预测

应用ProPred-Ⅰserver（http://www.imtech.res.in/raghava/propred1/）^[8]，在默认设置下预测人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）Ⅰ类结合表位。应用ProPred server（http://www.imtech.res.in/raghava/propred/）^[9]，在默认设置下预测HLAⅡ类结合表位。应用ABCpred server（http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html），在默认参数下预测HPV31 E6和E7基因的B细胞表位^[10]。

2 结果 2.1 HPV31 E6和E7基因突变

204例标本中，成功扩增并测序151例，剩余53例因拷贝数低或DNA提取液纯度低等原因导致测序失败。与HPV31 E6参考序列比对，16株（10.60%）病毒株与参考序列完全相同，135株（89.40%）存在基因多态性。共发现25个（5.56%）单核苷酸突变位点，其中14个为同义突变，11个为非同义突变。全部病毒株根据突变情况可分为20个种类，命名为HPV31 E601~HPV31 E620，其中HPV31 E601与参考序列完全相同。HPV31 E6基因中的所有突变见表 1、表 2。在151个HPV31 E7病毒株中共发现8个（2.69%）单核苷酸突变位点，其中3个是同义突变，5个是非同义突变。所有病毒株与参考序列相比均存在核苷酸突变，未发现与参考序列完全相同的病毒株。全部病毒株根据突变情况可分为8个种类，命名为HPV31 E701~HPV31 E708。HPV31 E7基因中的所有突变见表 3。在HPV31 E6和E7中未观察到移码突变或是导致终止密码子提前的突变，并且发现E7基因较E6基因更为保守。

2.2 系统发育分析

在全部的151例HPV31 E6序列中，A系出现频率最高（74例，49.01%），其次是C系（62例，41.06%），B系最低（15例，9.93%），见图 1A。在151个HPV31 E7序列中，同样是A系出现频率最高（74例，49.01%），其次是C系（71例，47.02%），B系最低（6例，3.97%），见图 1B。

2.3 选择压力分析

使用PAML4.9软件中的codeml程序推测所得突变是否为阳性选择位点，但在本研究所得突变中并未发现阳性选择位点。

2.4 蛋白质二级结构预测

HPV31 E6中共11个非同义突变，其中7个发生在无规则卷曲结构，3个发生在线性结构，1个发生在α螺旋结构。HPV31 E6和E7蛋白质二级结构见图 2。序列中非同义突变位点所在二级结构见表 1~3。

2.5 表位预测

HPV31 E6中预测到MHCⅠ类表位9个，MHCⅡ类表位7个，B细胞表位5个。大部分HPV31 E6中的非同义突变存在于预测表位中（图 3A）。HPV31 E7中预测到MHCⅠ类表位4个，MHCⅡ类表位5个，B细胞表位2个。大部分HPV31 E7中的非同义突变存在于预测表位中（图 3B）。

3 讨论

持续感染高危型HPV是宫颈癌发生、发展的关键。E6和E7基因编码的早期蛋白是目前高危型HPV中研究最多的关键致癌蛋白。已有大量研究证实，HPV16和HPV18 E6和E7基因多态性在病毒的生物学功能和临床疾病进展中具有重要意义。HPV31作为较高流行类型，有研究^[11]表明其可使宫颈上皮高级别病变的风险显著增加。本研究对中国东北地区HPV31 E6和E7基因多态性分布进行了研究。

本研究中，E7的突变频率较E6低，即与E6基因相比E7基因更为保守。在HPV31 E6基因中，A213T是最常见的同义突变，C413T（A138V）是最常见的非同义突变。在HPV31 E7基因中，C111T是最常见的同义突变，A184G（K62E）是最常见的非同义突变。有研究^[12-13]表明，HPV的型内突变可使疫苗的保护作用降低，改变病毒的致病能力，使病毒逃逸风险和致癌风险增加。当选择E6、E7作为引物设计或诊断检测以及疫苗设计的靶标时，有必要将这些突变位点考虑在内。本研究中，发生在不同蛋白质二级结构中的非同义突变很可能使蛋白质极性、亲水性电位和氨基酸侧链发生变化，从而可能改变癌蛋白折叠^[13]，进而使蛋白质功能发生改变。因此，非同义突变可能会通过改变E6和E7癌蛋白的结构来影响病毒的致癌潜力、与宿主细胞的相互作用以及疫苗效果。

研究^[14]报道HPV31 A谱系为美国女性中最广泛流行的谱系（41.7%），其次是C谱系（37.2%），B谱系最低（21.1%）。而在意大利，C谱系（65.8%）最为流行，其次是B谱系（29.3%），A谱系（4.9%）流行程度最低^[15]。本研究证实中国东北地区的分布情况与美国大致相同，与意大利存在差异，表明HPV31 E6和E7基因多态性的分布情况与地域和种族有一定相关性。

MHCⅠ/Ⅱ类表位和B细胞表位在疫苗设计和诊断方法的研究中具有重要意义。本研究在E6基因中预测到MHCⅠ类表位9个，MHCⅡ类表位7个，B细胞表位5个。非同义突变A11C（N4T）、T331C（C111R）和A154C（I52L）存在于MHCⅠ类表位，C178T（H60Y）、C430T（R144C）、A439G（T147A）同时存在于MHCⅡ类表位和B细胞表位，A190G（T64A）、T383C（I128T）、A409G（I137V）、C413T（A138V）存在于B细胞表位。在E7基因中预测到MHCⅠ类表位4个，MHCⅡ类表位5个，B细胞表位2个。非同义突变A29G（D10G）、C149A（S50Y）存在于MHCⅠ类表位，G136A（E46K）同时存在于MHCⅠ类表位和B细胞表位。这些突变均可能使表位发生改变，从而使表位的结合能力发生变化，影响其与宿主细胞的免疫作用。

综上所述，HPV31 E6和E7基因在中国东北地区呈基因多态性分布，本研究结果为更深入了解基因多态性的地理分布情况以及基因探针、疫苗和治疗方案的设计提供了理论依据。