含有E3泛素蛋白连接酶2的WW结构域（recombinant WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2，WWP2）是编码Nedd4家族成员中一种重要的E3连接酶^[1-3]。WWP2参与包括膜蛋白转运、蛋白质降解、信号转导以及转录凋亡等多种细胞过程，并与肿瘤等多种疾病的发生发展有关^[4]。急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是血液系统的一种异质性恶性肿瘤，预后较差，其病因和发病机制目前尚不明确。本研究拟观察WWP2对ALL细胞系生物学行为的可能的影响，旨在探讨该基因对ALL发生发展的潜在作用。

1 材料与方法 1.1 材料

ALL细胞系Jurkat来自中国医科大学附属第一医院血液研究室。RPMI-1640及PBS购自美国Gibco公司；polybrene、两性霉素B及嘌呤霉素购自日本Sigma公司；Higene购自中国普利莱公司；质粒购自中国吉凯公司；多柔比星（doxorubicin，dox）购自美国辉瑞制药有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学公司；细胞凋亡试剂盒及组织活性氧购自中国碧云天生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

用含10%FBS的RPMI-1640培养基，于37℃孵箱中培养Jurkat细胞。细胞传代3次后行台盼蓝染色，应用细胞计数仪计数细胞，存活率≥97%即可进行后续实验。

1.2.2 细胞转染

用PBS清洗细胞，接种至6孔板中（密度60%~70%），更换含polybrene（6 μg/mL）的培养基。分别加入60 μL含WWP2 shRNA及空载的病毒液孵育，48 h后再滴加60 μL，48 h后更换培养瓶，补5~10 mL培养液，观察细胞生长情况。转染结束后，向培养基中加入10 μg/mL嘌呤霉素进行阳性筛选。将1 mL 0.9% NaCl、24 μL转染试剂、HA质粒15 μL、WWP2质粒20 μL混匀后，室温静置20 min，加入细胞培养基中，36~48 h后观察细胞形态，进行后续实验。

1.2.3 CCK-8实验

将转染后Jurkat细胞（3.0×10⁵/mL）接种于96孔板中，100 μL/孔。设置空白孔，设置不同浓度（0、0.05、0.1、0.2、0.4 μmol/mL）dox药物处理组，每组4个复孔，孵育6 h，加入CCK-8试剂10 μL/孔，继续孵育1 h后，用酶标仪检测样品450 nm处OD值。

1.2.4 流式细胞术

将经过0.2 μmol/mL dox处理的细胞重悬于500 μL binding buffer中，分别加入细胞3 μL FITC和1 μL PI染料，混匀，同时设置3管FITC-/PI-、FITC+/PI-、FITC-/PI+，避光静置10~15 min，应用流式细胞仪检测。

1.2.5 活性氧检测

用无血清RPMI-1640稀释（1︰1 000）活性氧荧光探针（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）至终浓度10 μmol/L。收集细胞，与DCFH-DA充分接触，于37 ℃孵育30 min，每隔3~5 min颠倒混匀1次，用RPMI-1640洗涤细胞3次，充分去除未进入细胞的DCFH-DA。利用甩片机将细胞甩至载玻片，荧光显微镜下观察。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0和Graphpad prism 5软件进行统计分析。采用秩和检验的非参数检验方式分析，两变量相关程度采用双变量相关分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 WWP2表达水平与细胞增殖活性

分别用0、0.05、0.1、0.2、0.4 μmol/mL的dox刺激细胞48 h，通过CCK-8实验探讨WWP2对Jurkat细胞增殖活性的影响。结果表明，与未敲减的对照组相比，敲减WWP2后，细胞增殖活性明显减弱，差异有统计学意义（P < 0.01），而过表达WWP2后，细胞增殖活性则明显升高（P < 0.01），见图 1。当dox浓度为0.2 μmol/mL时，细胞增殖活性约为50%，因此选择该药物浓度进行后续实验。

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡情况

流式细胞术结果显示，加入dox后，敲减WWP2组细胞凋亡率较对照组明显增高（P < 0.01），而过表达WWP2基因组细胞凋亡率较对照组明显降低（P < 0.01），见图 2。提示WWP2基因可能作为癌基因抑制Jurkat细胞的凋亡。未经dox处理的各组细胞凋亡率无显著差异，WWP2低表达的细胞对dox更敏感，而WWP2表达水平较高的细胞对dox不敏感，因此，推测dox对细胞的损伤作用可能部分受WWP2基因调控。

2.3 细胞中活性氧检测结果

荧光显微镜下可见，与对照组相比，加入0.2 μmol/mL dox后，敲减WWP2组细胞更亮，细胞数相对更少（图 3A），而过表达WWP2组细胞更暗，细胞数相对更多（图 3B）。间接证明，敲减WWP2的Jurkat细胞产生的活性氧物质增多，而过表达WWP2的Jurkat细胞产生活性氧物质减少；dox对敲减WWP2的Jurkat细胞抑制作用明显增强，对过表达WWP2的细胞抑制作用则减弱。

3 讨论

WWP2基因位于染色体16q21.1，可在人类心脏、脑、肝脏、胰腺、肺及肾脏等器官表达。WWP2参与多种细胞过程，并与肿瘤相关底物结合，与肿瘤等多种疾病的发生发展有关^[4]。FUKUMOTO等^[5]发现，在人口腔鳞状细胞癌细胞系中WWP2 mRNA表达上调，蛋白表达显著增加；敲除WWP2基因可抑制细胞增殖能力，但对迁移能力则无显著影响。研究^[6-10]表明，WWP2在多种实体肿瘤中表达水平上调，发挥癌基因的作用。有学者研究了WWP2与淋巴瘤的关系，发现该基因可作为生物标志物鉴别反应性滤泡增生和滤泡性淋巴瘤。文献^[11-12]报道，日本蟾蜍毒治疗对多发性骨髓瘤诱导的骨溶解具有抑制作用。

ALL是一种血液系统恶性肿瘤，以未成熟的淋巴样细胞分化和增殖受损为主，发生于骨髓、外周血或某些髓外组织中^[13]。ALL多发病于2~5岁或50岁后^[14]。近年来，儿童ALL治愈率明显提高，而成人ALL预后远不如小儿^[15]，长期无病生存率仅为35%~45%^[16-17]。ALL预后较差，治愈率仅为20%~40%^[18]。WWP2在多种实体肿瘤中均发挥癌基因的作用^[7-10]，而它在血液系统，尤其是ALL中的作用机制尚未明确。本研究首次探讨了WWP2在ALL中的作用，通过细胞增殖实验、流式细胞术以及活性氧染色等方法观察了WWP2基因对ALL细胞系Jurkat的生物学行为的影响。结果显示，敲减WWP2基因使Jurkat细胞增殖活性降低，细胞凋亡增多，产生活性氧减少，而过表达WWP2产生的作用则相反。本研究还发现，WWP2基因敲减的细胞对dox更加敏感，而WWP2过表达的细胞对dox的敏感性则明显降低。这意味着对WWP2低表达的患者应用dox药物治疗可能产生良好的效果，但WWP2高表达的患者则应考虑选择其他合适的药物进行治疗。因此，临床上可以对所有ALL初治患者进行WWP2表达水平检测，其结果将会为ALL疾病的治疗及预后提供依据。另外，WWP2也许可作为指导ALL患者的治疗及预后的靶基因，为相关靶向药物研究及复发难治患者的治疗提供新的思路。

综上所述，本研究首次证明了WWP2基因可能是ALL新的潜在癌基因，有望为疾病诊断、治疗和预测预后提供新的靶点。此外，对WWP2低表达的患者，dox是一种很有效的药物，而对WWP2高表达的患者应慎重选择其他合适的化疗药物。