我国是食管癌高发地区，2017年《国家癌症中心最新研究报告》报道，食管癌发病率为14.09/10万，居我国肿瘤发病第五位^[1]。尽管治疗技术在不断改进^[2]，但患者总体预后仍然较差^[3]。锌指蛋白（zinc finger protein，ZNF）是最大的DNA结合蛋白家族，ZNF DNA结合域通常与核酸酶或其他效应蛋白融合介导表观遗传反应^[4]，调节基因的表达，进而影响肿瘤的发生、发展。研究^[5]发现，ZNF568基因低表达与胃癌不良预后相关，可作为判断肿瘤预后的标志物。然而，目前尚无ZNF568基因表达联合DNA甲基化与食管癌预后的关联研究。因此，本研究通过联合分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库ZNF568基因表达和DNA甲基化与食管癌预后的关联，为食管癌预后的预测提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 TCGA数据库数据下载与预处理

通过TCGA数据库官网（https://portal.gdc.cancer.gov），下载食管癌DNA甲基化数据、基因表达数据与临床数据，使用Perl脚本进行注释，并对注释后的数据进行预处理。

1.2 癌细胞系百科全书（Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE）数据库数据下载

通过CCLE数据库官网（https://portals.broadinstitute.org/ccle/），下载食管癌ZNF568基因表达和DNA甲基化数据，验证ZNF568基因表达和DNA甲基化之间的关联。

1.3 统计学分析

采用R软件中的limma包对DNA甲基化数据进行芯片归一化处理，并对食管癌癌组织与癌旁组织进行DNA甲基化差异分析；使用edgeR包分析食管癌癌组织与癌旁组织ZNF568基因的表达情况；筛选条件为错误发现率（false discovery rate，FDR）=0.05，fold change=1。ZNF568基因表达水平与DNA甲基化的关联分析使用Spearman秩相关。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，通过log-rank检验进行生存曲线的比较；使用Cox回归模型对ZNF568基因表达和DNA甲基化与食管癌患者预后的关联进行单因素和多因素分析，计算风险比（hazard ratio，HR）和95%可信区间（confidence interval，CI）。建立预测Cox回归分析模型列线图，内部验证采用Bootstrap法，采用一致性指数（C指数）评价模型准确度。本研究使用R软件（3.5.3）进行统计分析，显著性检验为双侧检验，检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 TCGA数据库食管癌癌组织和癌旁组织ZNF568基因表达和DNA甲基化差异分析

采用R软件中的limma包对186例食管癌癌组织和16例癌旁组织进行ZNF568 DNA甲基化差异分析，发现ZNF568基因在癌组织中的甲基化水平高于癌旁组织（FDR < 0.001）；采用edger包对159例食管癌癌组织与10例癌旁组织进行ZNF568基因表达差异分析，发现ZNF568基因在癌旁组织中的表达水平高于癌组织（FDR < 0.001）。见图 1。

2.2 DNA甲基化与基因表达水平的关联分析

对159例癌组织中ZNF568基因表达水平与DNA甲基化进行关联分析，结果发现，ZNF568基因表达水平与DNA甲基化存在负相关（P < 0.001），见图 2。

2.3 CCLE数据库验证ZNF568基因表达水平与DNA甲基化的关联性

下载CCLE数据库中食管癌细胞系（17种食管癌细胞株）ZNF568基因表达、DNA甲基化数据，Spearman秩相关分析发现，ZNF568基因表达水平与DNA甲基化存在负相关（P = 0.002），见图 3。

2.4 联合分析ZNF568基因表达和DNA甲基化与食管癌预后的关联

Kaplan-Meier法绘制的生存曲线和log-rank检验分析发现，ZNF568基因表达和DNA甲基化与食管癌生存无关联（P = 0.059，图 4）。调整性别、年龄、分化程度和TNM分期后，多因素Cox回归分析发现，ZNF568基因表达水平和DNA甲基化联合分析与食管癌预后存在关联，ZNF568基因高表达、DNA低甲基化能改善食管癌预后（HR = 0.70，95% CI：0.51~0.96，P = 0.043），见表 1。

2.5 构建ZNF568基因表达和DNA甲基化联合分析的列线图

使用多因素Cox回归分析的变量构建列线图（图 5），ZNF568基因表达和DNA甲基化联合分析能很好地预测食管癌预后，C指数为0.697（95% CI：0.543~0.851）。

3 讨论

TCGA是一个国际项目，收集了高质量的肿瘤和正常组织样本，并在多个高通量平台上进行了分子分析，收录了各种人类肿瘤的基因组变异、mRNA表达、DNA甲基化、临床信息等数据^[6]。在大数据时代的背景下，生物信息学分析利用如TCGA数据库等高通量数据库，在肿瘤的全面研究中发挥了重要作用。本研究通过TCGA数据库联合分析食管癌DNA甲基化和基因表达的数据发现，ZNF568基因高表达、DNA低甲基化能改善食管癌预后，使用ZNF568基因表达和DNA甲基化联合分析构建的列线图能很好地预测食管癌预后，C指数为0.697，说明ZNF568基因表达和DNA甲基化联合分析可作为预测食管癌预后的标志物。

ZNF是最大的DNA结合蛋白家族，可作为真核生物中的转录因子，并通过特征性锌指结构域选择性结合靶基因启动子中的特定DNA序列^[7-8]。ZNF DNA结合域通常与核酸酶或其他效应蛋白融合介导表观遗传反应^[4]。不同肿瘤的研究^[9]已经证明宿主DNA高甲基化导致肿瘤抑制基因沉默，而低甲基化区域与癌基因的表达增加。目前，尚无ZNF568基因表达联合DNA甲基化与食管癌预后的研究，但ZNF家族基因DNA甲基化和基因表达与肿瘤预后已有研究报道。使用TCGA数据库，ZHANG等^[10]发现，ZNF726基因低表达能改善结肠癌的预后（HR = 0.55，95% CI：0.34~0.89），使用CCLE数据库进一步评估结肠癌细胞中ZNF726基因表达，发现甲基化的调节对ZNF726基因起重要作用。此外，在肺鳞状细胞癌的研究^[11]中发现，ZNF454基因是肺鳞状细胞癌预后相关的甲基化驱动基因，通过联合分析ZNF454基因表达和DNA甲基化的数据，发现ZNF454基因低表达、DNA高甲基化能改善肺鳞状细胞癌的预后（P < 0.05）；对肺鳞状细胞癌ZNF454甲基化驱动基因进行通路分析，发现ZNF454基因主要作用的途径为“通用转录”“ RNA聚合酶Ⅱ转录”和“基因表达”，提示ZNF454基因表达和DNA高甲基化存在关联。以上的研究说明ZNF家族基因甲基化与肿瘤预后存在关联，可作为判断肿瘤预后的标志物。

目前，仅有一篇研究报道了ZNF568基因表达与胃癌的关联，WANG等^[5]使用TCGA数据库发现，ZNF568基因等5个基因是胃癌的突变基因，ZNF568基因低表达与胃癌预后存在关联（P < 0.05），ZNF568基因表达可作为预测胃癌预后的标志物。然而，目前尚无ZNF568基因表达和DNA甲基化与肿瘤预后的相关研究。本研究通过使用TCGA数据库，联合分析ZNF568基因表达和DNA甲基化发现，ZNF568基因高表达、DNA低甲基化与食管癌预后相关；构建ZNF568基因表达和DNA甲基化联合分析的列线图，结果显示，使用该基因能很好地预测食管癌的预后（C指数为0.697），说明ZNF568基因表达和DNA甲基化联合分析可用于预测食管癌预后。与经典遗传学改变不同，甲基化修饰的过程动态可逆^[12]，因此，抑制ZNF568 DNA甲基化作用可使上调ZNF568基因重新表达，这一特性也为食管癌的临床治疗提供新的思路。

综上所述，ZNF568基因高表达、DNA低甲基化与食管癌预后相关，检测食管癌ZNF568基因表达水平和DNA甲基化程度有助于判断食管癌的预后。