动脉粥样硬化是冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑梗死和周围血管疾病的主要病因^[1-2]。动脉粥样硬化的病理基础是脂质代谢紊乱，其特征是内膜和中膜的动脉病变^[3]。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是动脉壁的重要组成部分，其功能变化可能参与动脉粥样硬化^[4-5]。VSMCs的功能变化也发生在重要器官（心脏、脑和肾脏^[6-7]）血管中，可引起局部缺血和坏死（心肌梗死、脑梗死和肾梗死^[8]）。然而，目前VSMCs促成动脉粥样硬化的具体分子机制尚不完全清楚。

最近，已经充分确信了人类基因组表达的表观遗传调控，特别是长链非编码RNA（long-chain noncoding RNA，lncRNA）的功能^[9]。lncRNA已确定与心血管疾病（动脉粥样硬化、心肌纤维化、脂质代谢和血管内皮异常等）有关^[10]。在由氧化修饰的低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）诱导的VSMCs中，尿路上皮癌相关1（urothelial carcinoma-associated 1，UCA1）lncRNA通过下调磷酸酶和张力蛋白同源蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）来上调表达并拮抗miR-26a，从而调节增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、α-SMA和SM22-α的表达^[11]。在ox-LDL处理的人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells，HCAECs）中，lncRNA MALAT1表达上调，敲除MALAT1可以通过结合miR -155/SOCS1轴促进ox-LDL处理的HCAECs的细胞因子释放和细胞凋亡^[12]。本研究探讨lncRNA NEAT1在VSMCs增殖和凋亡中的作用及其信号传导机制。

1 材料与方法 1.1 材料

人主动脉VSMCs购自美国ATCC细胞库。TRIzol试剂盒购自宝生物工程有限公司。转染试剂Lipofectamine^TM3000购自美国Invitrogen公司，DEME培养基购自美国GE公司，RT-PCR试剂盒购自南京诺唯赞生物工程有限公司。PCR仪为ABI 7500，酶标仪为Thermo FC。β-actin及hnRNPA1抗体购自上海赛信通生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染

VSMCs用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DEME培养基于37 ℃、5%CO₂培养，48 h消化传代。为了探究lncRNA NEAT1在动脉粥样硬化环境中的表达是否不同，对VSMCs给予ox-LDL梯度浓度处理，分别在细胞培养液中加入0、25、50、100、150 mg/L的ox-LDL后继续培养VSMCs 48 h。按照试剂说明书要求取处于对数生长期的VSMCs，待细胞生长密度约为70%时经Lipofectamine^TM3000进行转染，继续在培养箱内常规培养48 h后收集细胞用于后续实验。

1.2.2 实时定量PCR

使用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书要求操作。逆转录反应为20 μL反应体系，反应条件25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。以18 S作为内参，实时PCR反应采用20 μL反应体系，反应条件为95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。2^-△△Ct法分析数据，所有反应均设3个复孔，实验重复3次。NEAT1引物序列：F，5’-CAGTTAGTTTATCAGTTCTC CCATCCA-3’；R，5’-GTTGTTGTCGTCACCTTTCAAC TCT-3’。

1.2.3 CCK-8实验

使用胰酶消化细胞，按照每孔3×10³个细胞将细胞添加至96孔板，每组为5个复孔，于培养箱内继续常规培养，分别于1、2、3、4、5 d在每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培养箱继续培养2 h，使用酶标仪测量各孔的吸光度值。

1.2.4 细胞凋亡实验

VSMCs加入处理因素48 h后进行实验。细胞用不含EDTA胰蛋白酶消化，1 500 g离心5 min后收集细胞，预冷的PBS洗涤2次，离心后收集细胞5×10⁵，加入100 μL 1×结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，再加入400 μL 1×结合缓冲液，轻轻混匀。样品在1 h内流式细胞仪检测。

1.2.5 Western blotting检

测VSMCs中hnRNPA1的表达培养或转染的细胞以RIPA缓冲液裂解，BCA法提取蛋白质定量，使用10%SDS-PAGE分离胶电泳分离蛋白质并转至PVDF膜，使用5%胎牛血清4 ℃封闭膜过夜。分别孵育hnRNPA1及β-actin一抗（1 : 1 000稀释）及二抗（1 : 5 000），最后用ECL底物试剂盒检测，实验重复3次。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17. 0统计软件进行分析，计量资料以x ±s表示，2组间比较采用t检验，3组比较先采用方差分析，然后两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 lncRNA NEAT1对VSMCs增殖、凋亡的影响

结果显示，使用0、25、50、100、150 mg/L ox-LDL处理后的VSMCs中NEAT1表达分别为1.09±0.08、1.38±0.07、3.13±0.07、5.11±0.10、5.42±0.11。与0、25 mg/L ox-LDL处理组比较，50、100、150 mg/L oxLDL处理组NEAT1表达明显增高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。

VSMCs与ox-LDL（100 mg/L）一起培养0、6、12、24、48 h，NEAT1的表达分别为1.07±0.11、1.30±0.07、2.15±0.15、3.25±0.25、5.49±0.20。与一起培养0、6、12 h比较，24、48 h时NEAT1的表达增高显著（P < 0.05）。可见NEAT1的表达随着处理时间的延长而增加。

将靶向NEAT1的特殊寡核苷酸转染到VSMCs中以沉默NEAT1的表达。CCK-8增殖测定表明，与对照组（siRNA-NC组）比较，si-NEAT1组VSMCs增殖活性显著降低（P < 0.05）。表明NEAT1沉默抑制了VSMCs的增殖活性（图 1）。与对照组比较，转染siNEAT1后VSMCs表现诱导细胞早期凋亡（图 2）。

2.2 miR-490-3p的表达

si-NEAT1转染细胞中miR-490-3p表达检测，结果显示，与si-NEAT1转染前（0.43±0.05）比较，siNEAT1转染后（1.01±0.07）miR-490-3p表达显著增高（P < 0.05）。然而NEAT1表达在miR-490-3p表达上调前后分别为0.98±0.06、0.97±0.04，差异无统计学意义（P > 0. 05），可见miR-490-3p表达上调并不影响NEAT1表达，因此推断miR-490-3p可能是NEAT1的抑制剂靶点。

2.3 starBase V3.0软件预测NEAT1互补结合的下游miRNA及基因

结果显示，NEAT1可与miR-490-3p互补结合；miR-490-3p可与Hnrnp A1 mRNA互补结合，见图 3。

2.4 Western blotting检测VSMCs中hnRNPA1表达

结果显示，与si-NC组（1.37±0.04）比较，si-NEAT1转染组（1.11±0.07）hnRNPA1表达显著降低（P < 0.05）。与NC组（1.89±0.07）比较，miR-490-3p过表达组（1.18±0.06）hnRNPA1表达显著降低（P < 0.05），见图 4。表明NEAT1/miR-490-3p/hnRNPA1信号通路在VSMCs的增殖和凋亡中具有重要作用。

3 讨论

已有研究^[13]表明lncRNA与血管平滑肌细胞的增殖和侵袭有关。MANG等^[14]报道lncRNA NEAT1可以通过调节hnRNPA2的表达促进肝癌细胞的发生发展，且该调控与NEAT1-U2AF65蛋白复合物有关。SUN等^[15]研究发现，NEAT1通过与miRNA-19a- 3p结合来上调SMYD2，从而促进心脏肥大的发生和发展。ZOU等^[16]报道NEAT1可以通过刺激miR-224- 5p促进黑素瘤细胞的增殖和侵袭，这表明NEAT1/ miR-224-5p轴可以作为黑素瘤标记物。然而lncRNA NEAT1在VSMCs中的具体作用机制尚不完全清楚。

本研究结果表明lncRNA NEAT1对VSMCs具有促进增殖作用，在经ox-LDL处理过的细胞中呈高表达，NEAT1沉默能够抑制VSMCs的增殖。lncRNA能够调控miRNA的表达和活性，LI等^[17]发现lncRNA NEAT1通过海绵效应吸附miR-23c来促进小鼠肾小球系膜细胞的增殖、纤维化和上皮-间质转化，同时阻止小鼠肾小球系膜细胞凋亡，进而促进糖尿病性肾病的发生和发展，表明NEAT1可作为糖尿病性肾病治疗的有效标志物和潜在治疗靶点。WEI等^[18]证明了lncRNA NEAT1通过海绵效应吸附miR-144- 3p来调节NF- κB信号传导途径，促进败血症诱导的心肌损伤进展，揭示了NEAT1对脓毒症和脓毒症所致心肌损伤的作用。lncRNA和miRNA在VSMCs中的研究目前鲜有报道，还需要大量实验予以证实。本研究证实了miR-490-3p为NEAT1的抑制靶标，下调NEAT1的表达能够增加miR-490-3p表达，但是miR-490-3p表达增高并不能影响NEAT1表达，因此认为miR-490-3p是NEAT1的直接靶标。

hnRNPA1属于保守的不均一性核糖核蛋白家族。研究^[19]显示hnRNPA1主要有影响转录、mRNA剪切、核穿梭、miRNA生物合成4种功能。已有研究^[20]表明hnRNPA1改变会影响转录后调控的不同RNA代谢过程，这种改变也参与癌症、神经降解性疾病和阿尔茨海默病。WEN等^[21]发现lncRNA ANCR通过抑制hnRNPA1降解和海绵吸附miR-140-3p来上调hnRNPA1的表达，进而促进肝癌细胞转移，表明hnRNPA1可以促进肝癌细胞的增殖和迁移。NISHIKAWA等^[22]研究表明hnRNPA1和hnRNPU调节TRA2B转录和外显子2的可变剪接并且在结肠癌细胞的异常增殖中起关键作用。本研究si-NEAT1转染VSMCs中hnRNPA1表达显著降低，同时在miR- 490-3p过表达的VSMCs中hnRNPA1表达显著降低。表明过表达lncRNA NEAT1通过使miR-490-3p/ hnRNPA1轴海绵化而促进VSMCs增殖。

综上所述，miR-490-3p是NEAT1的抑制靶标，lncRNA NEAT1通过激活miR-490-3p/ hnRNPA1轴促进VSMCs增殖、减少VSMCs早期凋亡。因此认为NEAT1有望成为动脉粥样硬化基因治疗的新靶标。