2020, Vol. 49文章信息
- 张玉, 韩佳利
- ZHANG Yu, HAN Jiali
- 法舒地尔对变应性鼻炎小鼠鼻黏膜中Th1/Th2、Th17/Treg相关细胞因子的影响
- Effects of fasudil on Th1/Th2 and Th17/Treg-related cytokines in the nasal mucosa of mice with allergic rhinitis
- 中国医科大学学报, 2020, 49(7): 593-596
- Journal of China Medical University, 2020, 49(7): 593-596
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文章历史
- 收稿日期：2019-07-02
- 网络出版时间：2020-06-28 15:30
引用本文 |
变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是常见的上呼吸道慢性炎症[1]，常由环境抗原（尘螨、植物花粉和动物蛋白等）刺激导致，是以辅助性T细胞（T helper cell，Th）2细胞因子优势表达、IgE过度合成、嗜酸性粒细胞选择性浸润为特征的疾病。Th1/ Th2[2]、Th17/调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）[3]的免疫失衡是目前已知的变应性鼻炎发病的重要机制。Th1、Th2、Th17、Treg均属于CD4+T细胞。干扰素γ（interferon γ，IFN-γ）、白细胞介素4（interlukin-4，IL-4）、IL-17、Foxp3 分别是Th1、Th2、Th17、Treg的主要效应因子[4]。AR研究已有数个世纪的历史，对其症状的控制越来越成熟，但彻底治愈AR仍是耳鼻咽喉科的难点问题。AR的发病机制、免疫调控网络体系和治疗方案仍在不断探索中。法舒地尔是Rho激酶抑制剂。已有研究[5-6]表明Rho激酶通过介导气道平滑肌收缩[7]、炎症细胞迁移[8]在哮喘[9]、AR[10]等慢性气道炎症疾病的发生过程中起重要作用[11]。Rho激酶抑制剂可有效抑制和逆转气道高反应性和气道重建，减轻变应性气道炎症和黏液分泌[12]。
本研究建立AR小鼠模型，选用盐酸法舒地尔作为治疗药物，观察小鼠鼻黏膜局部炎症反应，检测小鼠鼻黏膜中Th1/Th2、Th17/Treg分泌的代表性细胞因子IFN-γ/IL-4、IF-17/ Foxp3 的mRNA表达情况，旨在探讨法舒地尔在AR中的作用及产生的影响。
1 材料与方法 1.1 实验动物、试剂及分组6~8周龄C57小鼠24只（中国医科大学药理学实验室提供），雌雄各半，体质量18~22 g；试剂主要包括卵清蛋白（ovalbumin，OVA，美国Sigma公司）、AL（OH）3、盐酸法舒地尔（天津红日药业股份有限公司）。将小鼠随机分为AR组（AR小鼠未给予药物治疗，n = 8）、法舒地尔组（AR小鼠给予法舒地尔治疗，n= 8）、对照组（正常小鼠，n= 8）。
1.2 AR小鼠模型建立 1.2.1 致敏阶段将100 μg OVA与2 mg AL（OH）3溶于100 μL生理盐水配制OVA溶液。AR组和法舒地尔组小鼠分别于模型建立0、3、7、10 d腹腔注射OVA溶液（100 μL）。正常对照组小鼠相同时间注射等量生理盐水。
1.2.2 激发阶段将500 μg OVA溶于10 μL生理盐水配制OVA溶液。AR组和法舒地尔组小鼠于模型建立15~21 d OVA溶液滴鼻，每侧鼻孔10 μL，连续7 d。法舒地尔组小鼠每次OVA溶液滴鼻激发前0.5 h腹腔注射法舒地尔（10 mg/kg），连续7 d。正常对照组处理时间同法舒地尔组，药物均用等量生理盐水替代。
末次鼻腔致敏后30 min内观察小鼠打喷嚏、挠鼻、抓脸、鼻溢等症状。记分标准[10]：（1）鼻痒，轻搔鼻1~ 2次，1分；剧烈抓挠鼻面不止，3分；介于二者之间，2分。（2）喷嚏，1~ 3个，1分；4~ 10个，2分；11个以上，3分。（3）流涕，流至前鼻孔，1分；超出前鼻孔；2分；涕流满面，3分。以上各项指标均采用叠加量化记分法。总分>5分表示AR模型建立成功。
1.3 组织切片及染色各组选取2只小鼠于末次激发后2 h处死，然后取鼻黏膜投入4%多聚甲醛中固定，包埋成蜡块，蜡块切片（厚度5 μm）。HE染色，镜检观察。
1.4 实时荧光定量PCR末次激发2 h后小鼠脱颈椎处死、断头。迅速打开鼻腔，取出鼻黏膜后立即投入液氮冻融。应用Trizol试剂提取小鼠鼻黏膜组织细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA的质量浓度及鉴定纯度。使用RT试剂盒将0.1 ng~5 μg总RNA逆转录成cDNA。使用ABI7500实时PCR检测。引物序列：IFN-γ，上游引物5’-ATGAACGCTACACACTGCATC-3’；下游引物5’-CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC-3’。IL-4，上游引物5’-GGTCTCAACCCCCAGCTAGT-3’；下游引物5’-GCCGATGATCTCTCTCAAGTGAT-3’。IL-17，上游引物5’-TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA-3’；下游引物5’-CTTTCCCTCCGCATTGACAC-3’。Foxp3，上游引物5’-CCCATCCCCAGGAGTCTTG-3’；下游引物5’-ACCATGACTAGGGGCACTGTA-3’。β-actin，上游引物5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’；下游引物5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。
1.5 统计学分析采用GraphPad prism 6.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，2组比较采用独立样本t检验，3组比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 3组小鼠症状比较结果显示，与对照组比较，AR组小鼠AR症状明显（P < 0.05）；与AR组比较，法舒地尔组AR症状明显减轻（P < 0.05），见表 1。
| Group | Itchy nose | Sneezing | Runny nose | |
| Control | 0.875±0.035 4 | 0.750±0.046 3 | 0.250±0.046 3 | |
| AR | 2.875±0.035 41） | 2.875±0.035 41） | 1.125±0.035 41） | |
| Fasudil | 1.750±0.070 72） | 1.875±0.035 42） | 0.500±0.053 52） | |
| 1）P < 0.05 vs control group；2）P < 0.05 vs AR group. | ||||
2.2 各组小鼠鼻黏膜HE染色结果
光镜下结果显示，AR组黏膜可见明显肿胀及大量嗜酸性粒细胞浸润。与AR组比较，法舒地尔组鼻黏膜肿胀减轻，嗜酸性粒细胞浸润减少。而对照组未见黏膜肿胀及嗜酸性粒细胞浸润，见图 1。
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| A，control group；B，AR group；C，fasudil group. 图 1 各组小鼠鼻黏膜HE染色结果×40 Fig.1 HE staining results of the nasal mucosa in each group × 40 |
2.3 各组小鼠鼻黏膜中IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、IL-17 mRNA及Foxp3 mRNA表达
结果显示，与对照组比较，AR组IL-4 mRNA、IL- 17 mRNA表达明显升高，IFN-γ mRNA、Foxp3 mRNA表达明显降低，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。与AR组比较，法舒地尔组IL-4 mRNA表达明显降低，IFN-γmRNA、Foxp3 mRNA、IL-17 mRNA表达明显升高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表 2。
| Group | >IFNγ- mRNA | IL-4 mRNA | IL-17 mRNA | Foxp3 mRNA |
| Control | 0.969 0±0.035 0 | 0.981±0.038 | 0.965±0.035 | 0.965±0.004 |
| AR | 0.000 7±0.000 21） | 1.545±0.0361） | 1.829±0.0221） | 0.138±0.0041） |
| Fasudil | 1.549 0±0.026 02） | 0.056±0.0022） | 2.845±0.0302） | 2.457±0.0082） |
| 1）P < 0.05 vs control group；2）P < 0.05 vs AR group. | ||||
3 讨论
AR是由炎症细胞和免疫细胞参与的变态反应。针对某种变应原的特异性IgE[13]抗体是引起Ⅰ型超敏反应的主要因素。CD4+T细胞分泌的细胞因子调节IgE的表达[14]。
CD4+T细胞包括Th1、Th2、Th17、Treg等。其中Th2在过敏性疾病中起着关键作用[15]。Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡在AR患者的发病中发挥重要作用[16]。Th1、Th2、Th17、Treg及其代表性的细胞因子（IFN-γ、IL-4、IL-7）和转录因子Foxp3 之间存在着相互调节关系[17]。本研究结果表明，与对照组比较，AR组IL-4 mRNA、IL-17 mRNA表达明显升高，IFN-γ mRNA、Foxp3 mRNA表达降低（均P < 0.05），与以往研究[18-19]结果一致。
Rho/ Rho激酶通路能够调节细胞骨架动力学，影响细胞迁移、运动[20]。Rho激酶抑制剂能阻碍巨噬细胞功能[21]。阻断Rho激酶2活性可显著抑制炎症黏膜中的促炎性细胞因子[22]。本研究发现法舒地尔能够抑制AR小鼠鼻黏膜的炎症反应，猜测可能是由于Rho激酶抑制剂抑制免疫细胞迁移、趋化并对免疫反应进行调节，减少了AR小鼠鼻黏膜中嗜酸性粒细胞浸润所致，与以往研究[23]结果一致。
Rho激酶上游信号Rho-GDP酶激活认为是免疫反应协调的关键事件，阻断Rho激酶2活性能抑制CD4+T细胞分化为Th1和Th17细胞，促进了Treg细胞分化[22]。法舒地尔处理过的小胶质细胞能够显著上调Treg细胞[24]。本研究结果表明法舒地尔对AR小鼠鼻黏膜免疫细胞的细胞因子表达水平均有影响，IL-4表达明显降低，IFN-γ、Foxp3 表达明显升高。但本研究中法舒地尔治疗后IL-17 mRNA表达水平却异常升高，造成结果差异性的原因考虑可能和Th17的引物有关。
综上所述，法舒地尔能减轻AR小鼠鼻黏膜的炎症反应，明显降低IL-4表达水平，升高IFN-γ、Foxp3 的表达水平，改善鼻黏膜局部Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡。但对于IL-17的影响趋势有待于进一步研究证实。
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