2020, Vol. 49文章信息
- 李千会, 陈说, 赵杨
- LI Qianhui, CHEN Shuo, ZHAO Yang
- E2F1通过调节自噬相关蛋白表达促进卵巢癌细胞耐药
- E2F1 promotes drug resistance in ovarian carcinoma by regulating the expression of autophagy-related proteins
- 中国医科大学学报, 2020, 49(5): 448-453
- Journal of China Medical University, 2020, 49(5): 448-453
-
文章历史
- 收稿日期：2019-07-11
- 网络出版时间：2020-05-07 10:21
引用本文 |
卵巢癌是最致命的女性生殖系统恶性肿瘤，死亡率较高[1]。卵巢癌在早期阶段没有明显症状，因此，大多数患者在初诊时已处于晚期[2]。肿瘤切除手术联合铂类药物化学治疗（简称化疗）可用于多种实体肿瘤的治疗。顺铂自1989年开始被广泛用于治疗卵巢癌，但许多患者可出现顺铂耐药及肿瘤复发，且顺铂耐药的具体机制目前尚不明确[3]。E2F转录因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）属于E2F转录因子家族，参与多种肿瘤的发生、发展和耐药[4-7]。本研究组在前期研究[8]中发现，E2F1可通过调节miR-519d/RhoC途径促进卵巢癌的发生和发展。然而，E2F1是否参与卵巢癌耐药尚未见文献报道。因此，本研究拟探讨E2F1在卵巢癌细胞耐药中的作用及其可能的机制。
1 材料与方法 1.1 细胞培养和转染用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基（美国HyClone Logan公司）培养人卵巢癌细胞株A2780。另用含20 ng/mL顺铂的DMEM培养基培养人卵巢癌顺铂耐药株A2780/DDP。在常规培养期间，每2 d更换1次培养基。按照说明书用lipofectamine 3000（美国Invitrogen公司）进行细胞转染，分别用E2F1过表达质粒及小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染A2780/DDP细胞，上调或下调E2F1的表达。
1.2 MTT将细胞消化后接种于96孔板中（3×103/孔），孵育12 h，加入不同浓度的顺铂。待细胞培养48 h后加入5 mg/mL MTT（中国Solarbio公司）20 μL/孔，37 ℃孵育4 h，除去培养基/MTT溶液，加入DMSO（150 μL/孔）。使用微孔板分光光度计（美国Bio-Tek Instruments公司）测量吸光度。
1.3 RT-PCR用Trizol试剂盒（日本TaKaRa公司）从A2780、A2780/DDP及分别转染了E2F1过表达质粒和si-RNA的A2780/DDP细胞中提取总RNA，按照说明书逆转录cDNA。基于GenBank序列设计引物。使用SYBR Premix Ex Taq TMⅡ试剂盒（日本TaKaRa公司）进行RT-qPCR扩增。GAPDH用作内参基因。E2F1引物序列如下：F，5’-AACCGCTGTTGTCCCG-3’；R，5’-CAAGCCCTGTCAGAAATCC-3’。GAPDH引物序列如下：F，5’-AGCCTCAAGATCATCAGCAATG-3’；R，5’-CACGATACCAAAGTTGTCATGGAT-3’。
1.4 Western blotting变性蛋白（40 μg）上样，10%或15%SDS-PAGE凝胶电泳分离，转移至Hybond膜（德国Amersham公司），于3%牛血清白蛋白中37 ℃封闭2 h。加入一抗[E2F1抗体1︰1 000稀释、自噬相关蛋白7（autophagy related 7 homolog，ATG7）抗体1︰1 000稀释、死骨片蛋白（sequestosome 1，P62/SQSTM1）抗体1︰1 000稀释、自噬相关蛋白10（autophagy related 10 homolog，ATG10）抗体1︰1 000稀释，美国Proteintech公司；切除修复交叉互补蛋白1（excision repair cross-complementing group 1，ERCC1）抗体1︰300稀释、ATP结合蛋白C1（ATP-binding cassette，sub-family C member 1，ABCC1）抗体1︰300稀释、ATP结合蛋白G2（ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2）抗体1︰300稀释，中国北京Bioss公司；微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta，LC3）抗体1︰1 000稀释，美国Cell Signaling Technology公司]，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜10 min×3次，加入抗小鼠/兔IgG抗体（1︰5 000，美国Proteintech公司），室温下孵育2 h，洗膜10 min×3次。ECL Plus检测显影。β-actin（1︰3 000稀释，美国Proteintech公司）用作内参照。
1.5 免疫荧光染色在培养板中将融合度达到60%~80%的细胞爬片用PBS浸洗5 min×3次。4%甲醛固定30 min。PBS洗涤3次，0.2%Triton X-100室温下透化30 min。PBS洗涤3次，3%BSA室温下封闭30 min。加入一抗ATG7（1︰100稀释）、ATG10（1︰100稀释）、LC3（1︰100稀释）、P62（1︰100稀释），4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次，加入TRITC标记的二抗，室温下暗箱中孵育2 h，洗涤，DAPI孵育5 min，PBS洗涤。荧光显微镜下拍照。
1.6 统计学分析采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料用x±s表示。所有数据均为至少3次独立实验结果。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 A2780/DDP细胞中E2F1表达水平高于A2780细胞MTT检测结果显示，卵巢癌细胞系顺铂耐药株A2780/DDP（IC50：26.5 μmol/L）对顺铂的耐药性高于亲本A2780细胞（IC50：13.9 μmol/L），差异有统计学意义（P < 0.05），见图 1A。
|
| A, A2780/DDP (IC50:26.5 μmol/L) is more resistant to cisplatin than A2780 (IC50:13.9 μmol/L); B, E2F1 mRNA expression level in A2780/DDP is significantly higher than A2780;C, the protein expression level of E2F1 in A2780/DDP is higher than A2780. 图 1 A2780/DDP细胞中E2F1 mRNA和蛋白表达水平高于A2780细胞 Fig.1 E2F1 mRNA and protein were expressed at higher levels in cisplatin-resistant ovarian cancer cell line A2780/DDP than parental A2780 |
RT-PCR及Western blotting结果显示，A2780/DDP细胞中E2F1 mRNA和蛋白质表达水平显著高于A2780细胞，差异有统计学意义（P < 0.05），见图 1B、1C。
2.2 E2F1参与卵巢癌细胞耐药通过转染E2F1过表达质粒或E2F1 siRNA，上调或下调A2780/DDP中E2F1的表达，并应用Western blotting及RT-PCR检测转染效率。结果显示，转染E2F1过表达质粒后，A2780/DDP细胞中E2F1 mRNA和蛋白表达水平显著升高（P < 0.05，图 2A、2C）；在A2780/DDP细胞中转染E2F1 siRNA，E2F1 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P < 0.05，图 2B、2D）。
|
| A and C, transfection of E2F1 overexpression plasmid significantly increases mRNA and protein expression levels of E2F1; B and D, E2F-1 siRNA transfection significantly reduces E2F1 mRNA and protein expression levels. 图 2 E2F1过表达质粒/E2F1 siRNA转染上调/下调了E2F1的表达 Fig.2 Transfection of E2F1 overexpression plasmid or E2F1 siRNA upregulates or downregulates the expression of E2F1 |
MTT结果显示，E2F1的过表达降低了A2780/DDP细胞对顺铂的敏感性（P < 0.05，图 3A）；沉默E2F1具有相反的作用（P < 0.05，图 3B）。表明E2F1能增强卵巢癌细胞的顺铂耐药性。
|
| A, E2F1 overexpression reduces sensitivity of A2780/ DDP cells to cisplatin; B, silencing E2F1 increases sensitivity of A2780/DDP cells to cisplatin. 图 3 E2F1参与卵巢癌细胞耐药 Fig.3 E2F1 is involved in ovarian cancer cell resistance |
2.3 改变E2F1表达不影响耐药相关蛋白的表达
Western blotting结果显示，A2780/DDP细胞中E2F1的过表达或低表达对ERCC1、ABCC1或ABCG2的蛋白表达水平无显著影响（图 4）。表明E2F1并非通过调节耐药相关蛋白增强卵巢癌细胞的顺铂耐药性。
|
| 图 4 改变E2F1表达不影响耐药相关蛋白的表达 Fig.4 Altering E2F1 expression does not affect the expression of proteins involved in drug resistance |
2.4 E2F1通过调节自噬相关蛋白表达影响卵巢癌细胞耐药
本研究分别在A2780/DDP与A2780细胞中检测了自噬相关蛋白ATG7、ATG10、LC3、P62的表达水平。结果显示，与A2780细胞相比，A2780/DDP细胞中ATG7、ATG10和LC3蛋白表达水平升高，P62表达水平降低（图 5）。提示自噬可能在卵巢癌细胞顺铂耐药中发挥作用。
|
| 图 5 自噬相关蛋白在A2780/DDP与A2780中的表达 Fig.5 Differential expression of autophagy-related proteins in A2780/DDP and A2780 cells |
用顺铂处理的A2780/DDP细胞中E2F1的过表达增加了ATG7、ATG10和LC3的表达，并降低P62表达；而E2F1的敲低具有相反的效果（图 6）。这些结果证实，E2F1的过表达促进了A2780/DDP细胞中顺铂诱导的保护性自噬。
|
| A, Western blotting; B, immunofluorescence. Overexpression of E2F1 up-regulates ATG7, ATG10, LC3 expression and down-regulates P62 expression. Silencing E2F1 produced opposite results. 图 6 E2F1通过调节自噬相关蛋白表达影响卵巢癌细胞耐药 Fig.6 E2F1 promotes cisplatin resistance in ovarian cancer cells by regulating the expression of autophagy-related proteins |
3 讨论
E2F1在肿瘤组织中过表达可促进卵巢癌的发生和发展[7]。本研究结果显示，顺铂耐药卵巢癌细胞系E2F1表达水平高于亲本卵巢癌细胞系，而且转染编码E2F1的质粒降低了A2780/DDP细胞对顺铂的敏感性，而沉默E2F1则具有相反的作用，表明E2F1参与了卵巢癌的顺铂耐药。
肿瘤细胞耐药性与耐药相关基因的表达水平相关。ERCC1参与某些癌症中顺铂抗性的发展[9-10]。乳腺癌耐药蛋白BCRP/ABCG2是ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）家族中的药物转运蛋白，在化疗耐药中起着至关重要的作用[11-12]。ABCC1也称为多药耐药相关蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1），与多种癌细胞系的耐药性相关[13-14]。本研究通过评估耐药相关基因的表达水平，探讨了E2F1增强卵巢癌耐药性的分子机制。结果显示，在A2780/DDP细胞中过表达或敲低E2F1后，ERCC1、ABCC1和ABCG2的表达水并无改变，提示这些蛋白可能并未参与E2F1诱导的卵巢癌顺铂耐药。因此，E2F1可能通过调节其他基因促进卵巢癌顺铂耐药性。
越来越多的研究表明自噬在肿瘤耐药中起重要作用。自噬是一种进化上保守的过程，通过对长寿蛋白和功能失调细胞器的降解和更新提供代谢支持，以维持细胞稳态。自噬在细胞正常基础代谢水平持续发生，在应对饥饿、氧化应激或药物治疗等应激时上调[15]。肿瘤细胞可通过诱导自噬对抗肿瘤治疗药物产生耐药性[16-18]。LC3-Ⅱ是监测哺乳动物自噬和自噬相关过程的可靠标记[19]，P62（SQSTM1）累积表示对自噬体的清除被阻断。当LC3-Ⅱ上调时，P62下调，表明自噬正在进行，反之表示自噬过程被抑制[20]。ATG8和ATG12是形成自噬体所需的遍在蛋白样蛋白，ATG7是E1样连接酶，而ATG10是E2样连接酶，后二者对ATG12的缀合都是必需的。以上这些蛋白质的改变可导致自噬的丧失。在ATG8系统中，ATG12-ATG5缀合物能促进ATG8和磷脂酰乙醇胺之间的缀合，而ATG10以E3-酶非依赖性方式促进ATG12-ATG5缀合。增强的ATG7和ATG10水平足以诱导自噬[21]。本研究结果显示，与A2780细胞相比，顺铂耐药卵巢癌细胞系A2780/DDP中ATG7、ATG10、LC3表达水平升高，P62表达水平降低，提示顺铂耐药可能与A2780/DDP细胞中的自噬有关。研究[22-23]表明，E2F1通过参与相关的信号通路影响自噬。本研究发现，E2F1的过表达增加了ATG7、ATG10和LC3蛋白的表达，降低了P62的表达，而沉默E2F1则具有相反的效果。以上结果表明E2F1可能通过增加自噬导致卵巢癌细胞对顺铂的耐药。
综上所述，本研究表明E2F1可通过调节自噬相关蛋白，诱导卵巢癌细胞保护性自噬，并增强卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。
| [1] |
TORRE LA, TRABERT B, DESANTIS CE, et al. Ovarian cancer statistics, 2018[J]. CA Cancer J Clin, 2018, 68(4): 284-296. DOI:10.3322/caac.21456 |
| [2] |
LHEUREUX S, GOURLEY C, VERGOTE I, et al. Epithelial ovarian cancer[J]. Lancet, 2019, 393(10177): 1240-1253. DOI:10.1016/s0140-6736(18)32552-2 |
| [3] |
GHOSH S. Cisplatin:the first metal based anticancer drug[J]. Bioorg Chem, 2019, 88: 102925. DOI:10.1016/j.bioorg.2019.102925 |
| [4] |
ZHONG R, BECHILL J, SPIOTTO MT. Loss of E2F1 extends survival and accelerates oral tumor growth in HPV-positive mice[J]. Cancers (Basel), 2015, 7(4): 2372-2385. DOI:10.3390/cancers7040895 |
| [5] |
FANG ZJ, GONG CJ, LIU H, et al. E2F1 promote the aggressiveness of human colorectal cancer by activating the ribonucleotide reductase small subunit M2[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 464(2): 407-415. DOI:10.1016/j.bbrc.2015.06.103 |
| [6] |
TARANGELO A, LO N, TENG R, et al. Recruitment of Pontin/Reptin by E2f1 amplifies E2f transcriptional response during cancer progression[J]. Nat Commun, 2015, 6: 10028. DOI:10.1038/ncomms10028 |
| [7] |
ZHAN L, ZHANG Y, WANG WY, et al. E2F1:a promising regulator in ovarian carcinoma[J]. Tumour Biol, 2016, 37(3): 2823-2831. DOI:10.1007/s13277-015-4770-7 |
| [8] |
SANG XB, ZONG ZH, WANG LL, et al. E2F-1 targets miR-519d to regulate the expression of the ras homolog gene family member C[J]. Oncotarget, 2017, 8(9): 14777-14793. DOI:10.18632/oncotarget.14833 |
| [9] |
HAMILTON G, RATH B. Pharmacogenetics of platinum-based chemotherapy in non-small cell lung cancer:predictive validity of polymorphisms of ERCC1[J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2018, 14(1): 17-24. DOI:10.1080/17425255.2018.1416095 |
| [10] |
FORMICA V, DOLDO E, ANTONETTI FR, et al. Biological and predictive role of ERCC1 polymorphisms in cancer[J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2017, 111: 133-143. DOI:10.1016/j.critrevonc.2017.01.016 |
| [11] |
WESTOVER D, LI FZ. New trends for overcoming ABCG2/BCRPmediated resistance to cancer therapies[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2015, 34: 159. DOI:10.1186/s13046-015-0275-x |
| [12] |
CHEN ZL, SHI TL, ZHANG L, et al. Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette(ABC) family in multidrug resistance:a review of the past decade[J]. Cancer Lett, 2016, 370(1): 153-164. DOI:10.1016/j.canlet.2015.10.010 |
| [13] |
JOHNSON ZL, CHEN J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1[J]. Cell, 2017, 168(6): 1075-1085.e9. DOI:10.1016/j.cell.2017.01.041 |
| [14] |
WHITT JD, KEETON AB, GARY BD, et al. Sulindac sulfide selectively increases sensitivity of ABCC1 expressing tumor cells to doxorubicin and glutathione depletion[J]. J Biomed Res, 2016, 30(2): 120-133. DOI:10.7555/JBR.30.20150108 |
| [15] |
SAHA S, PANIGRAHI DP, PATIL S, et al. Autophagy in health and disease:a comprehensive review[J]. Biomedecine Pharmacother, 2018, 104: 485-495. DOI:10.1016/j.biopha.2018.05.007 |
| [16] |
LEVY JMM, TOWERS CG, THORBURN A. Targeting autophagy in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2017, 17(9): 528-542. DOI:10.1038/nrc.2017.53 |
| [17] |
WU T, WANG MC, JING L, et al. Autophagy facilitates lung adenocarcinoma resistance to cisplatin treatment by activation of AMPK/mTOR signaling pathway[J]. Drug Des Devel Ther, 2015, 9: 6421-6431. DOI:10.2147/DDDT.S95606 |
| [18] |
HE J, YU JJ, XU Q, et al. Downregulation of ATG14 by EGR1-MIR152 sensitizes ovarian cancer cells to cisplatin-induced apoptosis by inhibiting cyto-protective autophagy[J]. Autophagy, 2015, 11(2): 373-384. DOI:10.1080/15548627.2015.1009781 |
| [19] |
ZHANG H, CHANG JT, GUO B, et al. Guidelines for monitoring autophagy in Caenorhabditis elegans[J]. Autophagy, 2015, 11(1): 9-27. DOI:10.1080/15548627.2014.1003478 |
| [20] |
CHEN S, WU DD, SANG XB, et al. The lncRNA HULC functions as an oncogene by targeting ATG7 and ITGB1 in epithelial ovarian carcinoma[J]. Cell Death Dis, 2017, 8(10): e3118. DOI:10.1038/cddis.2017.486 |
| [21] |
DIKIC I, ELAZAR Z. Mechanism and medical implications of mammalian autophagy[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2018, 19(6): 349-364. DOI:10.1038/s41580-018-0003-4 |
| [22] |
HAIM Y, BLÜHER M, SLUTSKY N, et al. Elevated autophagy gene expression in adipose tissue of obese humans:a potential non-cellcycle-dependent function of E2F1[J]. Autophagy, 2015, 11(11): 2074-2088. DOI:10.1080/15548627.2015.1094597 |
| [23] |
KORAH J, CANAFF L, LEBRUN JJ. The retinoblastoma tumor suppressor protein(pRb)/E2 promoter binding factor 1(E2F1) pathway as a novel mediator of TGFβ-induced autophagy[J]. J Biol Chem, 2016, 291(5): 2043-2054. DOI:10.1074/jbc.M115.678557 |