卵巢上皮癌的死亡率居妇科肿瘤的首位^[1]。由于临床症状不典型，缺乏有效的筛查手段，导致大多数患者就诊时已近晚期。卵巢上皮癌术后易复发、转移，导致预后较差^[2-3]，晚期患者平均5年存活率仅约30%^[4]。因此，亟需寻找治疗卵巢上皮癌的有效药物。

肌浆/内质网Ca²⁺-ATP酶（sarco/endoplasmic reticulum Ca²⁺ ATPase，SERCA）是一种位于肌浆/内质网膜上的细胞内Ca²⁺泵。SERCA介导Ca²⁺从细胞质向肌浆/内质网转运，是维持细胞内Ca²⁺稳态的关键^[5]。有研究^[6]表明，脂肪肉瘤中SERCA2过表达能够激活细胞存活途径。SERCA2在结直肠癌细胞中的过度表达驱动增殖和迁移，在结直肠癌发生中起关键作用^[7]。卵巢癌细胞中SERCA2表达水平高于正常卵巢表面上皮细胞^[8]，提示SERCA2可能促进卵巢癌的发生发展。研究^[9-10]表明，抑制SERCA表达导致内质网钙储存池的耗尽，并使细胞内Ca²⁺水平升高，可能导致内质网和线粒体受损，从而导致细胞凋亡。毒胡萝卜素是SERCA2的特异性不可逆抑制剂，通过干扰内质网内Ca²⁺稳态诱导癌细胞凋亡^[11]。本研究拟探讨毒胡萝卜素在卵巢癌细胞中的作用及其潜在作用机制。

1 材料与方法 1.1 细胞培养及处理

本研究采用人卵巢癌细胞系OVCAR3和A2780。OVCAR3细胞在RPMI 1640培养基（美国HyClone公司）中培养，A2780细胞在DMEM培养基（美国HyClone公司）中培养。培养基中添加1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清。细胞在5% CO₂、37 ℃恒温培养箱中孵育。以毒胡萝卜素浓度0.031 25~1.0 μmol/L（OVCAR3）和0.062 5~2.0 μmol/L（A2780）进行细胞活力测定，筛选出最佳作用浓度（OVCAR3：0.062 5 μmol/L，A2780：0.25 μmol/L）进行后续实验，以加入DMSO为对照组。

1.2 细胞活力测定（MTT法）

收集并计数细胞，接种在96孔板中（3 000细胞/孔）。培养至细胞单层铺满孔底，加入不同浓度梯度的毒胡萝卜素，同时设置对照孔。在处理后0、24、48和72 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），孵箱中培养4 h。弃培养液，加入DMSO溶液150 μL/孔。用微孔板分光光度计（美国Bio-Tek Instruments公司）检测各孔在波长490 nm处的吸光度，计算半数抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC₅₀）。

1.3 细胞凋亡检测

用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞后，以1 500 r/min离心5 min，用冷PBS洗涤，以同样速度再次离心。弃PBS，加入1×binding缓冲液100 μL制作细胞悬液，在避光条件下，分别加入5 μL碘化丙锭（propidium iodide，PI）和5 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（美国BD Biosciences公司），轻轻混匀并室温孵育30 min，加入1×binding缓冲液400 μL，通过流式细胞术测定细胞的凋亡率。

1.4 Ca²⁺浓度测定

收集细胞并离心，PBS洗涤2次。用无胎牛血清培养基重悬细胞后，加入Fluo-3-AM（美国Biotium公司，终浓度5 μmol/L）。避光条件下，37 ℃孵育细胞30 min。离心并去除多余染料，PBS反复洗涤、离心3次。加入500 μL PBS重悬细胞后，进行流式细胞仪上机检测。

1.5 细胞划痕实验

将细胞接种于6孔板中，37 ℃培养至80%融合。用200 μL微量加样器枪头垂直于6孔板划痕，用PBS洗除划痕产生的细胞碎片后，在无胎牛血清培养基中培养细胞。在划痕后0和48 h时显微镜下拍照。使用ImageJ软件（美国National Institutes of Health）测量划痕区域的面积。计算细胞迁移率=（原划痕面积-不同时间点的划痕面积）/原划痕面积×100%。

1.6 细胞侵袭实验

用无血清培养基1:10稀释4 ℃放置过夜的基质胶（美国Sigma-Aldrich公司），并以30 μL/孔加入Transwell小室，置于培养箱孵育4 h。将重悬于200 μL无血清培养基中的细胞接种于Transwell上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养基作为趋化剂。37 ℃下孵育48 h，擦去上表面未穿透基质胶的细胞，PBS洗2遍。4%多聚甲醛固定15 min，行结晶紫染色，用PBS洗去染料。常温下晾干封片，倒置荧光显微镜（CKX53，日本Olympus公司）下拍照。

1.7 实时荧光定量PCR

使用Trizol试剂（日本TaKaRa公司）提取卵巢癌细胞总RNA。使用分光光度计（中国上海Unico公司）检测OD_{260 nm/280 nm}，计算RNA浓度。按照Promega逆转录试剂盒说明书，将RNA逆转录成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒（日本TaKaRa公司）扩增cDNA。每个靶基因的表达水平以18S mRNA为内参对照。各基因引物序列如下：SERCA2，5’-GGTGGCAACAGAACAGG-3’，5’-CCAGGCAGGTGGTGAT-3’；CCAAT增强子结合同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）基因，5’-ACTCTTGACCCTGCTTCTC-3’，5’-AGTCGCCTCTACTTCCCT-3’；血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）基因，5 ’-TGGGACAGTAGAAAGGG-3’，5’-AAGGGAGTGGTAGCAGTA-3’；B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，BCL2）基因，5’-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3’，5’-CTACCCAGCCTCCGTTATCC-3’；SURVIVIN，5’-CTTGGCCCAGTGTTTCTT-3’，5’-GCTTCCAGTCCCTCCCT-3’；B细胞淋巴瘤XL（B-cell lymphoma-XL，BCL-XL）基因，5’-TTCCCAGAAAGGATACAGC-3’，5’-GGGTCTCCATCTCCGATT-3’；18S，5’-GAAACGGCTACCACATCC-3’，5’-ACCAGACTTGCCCTCCA-3’。根据来自3个独立实验的样品阈值循环（Ct）分析数据。

1.8 Western blotting

使用细胞裂解液处理经毒胡萝卜素处理的卵巢癌细胞，蛋白定量。行SDS-PAGE电泳，转移至纤维素膜（德国Amersham公司）。用3%牛血清白蛋白在室温下封闭1.5 h，孵育一抗SERCA2、CHOP、VEGFA、Bcl-2、Survivin、Bcl-XL（1:1 000稀释，美国Proteintech公司），4 ℃孵育过夜，抗β-actin（1:2 000稀释，美国Proteintech公司）作为内参。次日用1×TBST洗膜3次，用山羊抗兔二抗（1:5 000稀释，中国Abbkine公司）在室温下孵育2 h，用1×TBST洗膜3次。用增强型化学发光试剂（美国Santa Cruz Biotechnology公司）曝光成像。

1.9 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。2组计量资料采用Student’s t检验进行比较。所有P值均为双侧，且P < 0.05为差异有统计学意义。每组实验至少重复3次。

2 结果 2.1 毒胡萝卜素抑制卵巢癌细胞的增殖

MTT结果显示，卵巢癌OVCAR3和A2780细胞分别暴露于浓度为0.031 25~1.0 μmol/L和0.062 5~2.0 μmol/L的毒胡萝卜素后，与对照组相比，卵巢癌OVCAR3和A2780细胞的增殖能力下降，并呈剂量依赖性（P < 0.05），见图 1。

毒胡萝卜素对OVCAR3的IC₅₀为0.270 3 μmol/L，对A2780的IC₅₀为0.899 4 μmol/L。在保证细胞活力的前提下，选取毒胡萝卜素浓度分别为0.062 5 μmol/L和0.25 μmol/L对应卵巢癌细胞系OVCAR3和A2780进行后续实验。

2.2 毒胡萝卜素可增加细胞质中Ca²⁺浓度并诱导卵巢癌细胞凋亡

流式细胞术分析结果显示，毒胡萝卜素能够增加卵巢癌细胞胞质中的Ca²⁺浓度（P < 0.05，图 2A），并能显著诱导卵巢癌细胞系OVCAR3和A2780的凋亡（P < 0.05，图 2B）。

2.3 毒胡萝卜素处理后卵巢癌细胞迁移和侵袭能力下降

进一步评估毒胡萝卜素处理后卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力的变化，结果表明，毒胡萝卜素能够显著降低卵巢癌细胞系OVCAR3和A2780的迁移和侵袭能力（P < 0.05，图 3、图 4）。

2.4 毒胡萝卜素作用下卵巢癌细胞中相关基因mRNA和蛋白表达的变化

经毒胡萝卜素处理后，SERCA2、VEGFA、BCL-2、BCL-XL和SURVIVIN mRNA和蛋白表达水平均下降，而CHOP的表达则增加（P < 0.05，图 5）。

3 讨论

SERCA抑制剂毒胡萝卜素是一种潜在的抑癌剂^[12]。研究^[13]表明，毒胡萝卜素与洋地黄毒苷对ER阴性乳腺癌细胞具有协同抑制作用。在前列腺癌中，毒胡萝卜素可通过激活凋亡途径诱导癌细胞死亡^[14]。此外，毒胡萝卜素还可通过破坏人肺癌细胞的细胞骨架诱导细胞凋亡^[15]。

本研究结果显示，不同浓度的毒胡萝卜素能够降低卵巢癌细胞系OVCAR3和A2780的细胞活力，且呈剂量依赖性。同时，卵巢癌细胞系OVCAR3和A2780的增殖在毒胡萝卜素浓度分别为0.062 5 μmol/L和0.25 μmol/L时受到显著抑制，因此，分别选取这2个浓度对应卵巢癌细胞系OVCAR3和A2780进行后续实验。毒胡萝卜素处理后，2种细胞的活力均降低，凋亡细胞的比例增加，迁移和侵袭能力下降。表明毒胡萝卜素可抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭，增加卵巢癌细胞的凋亡。

钙调节泵SERCA在维持细胞内Ca²⁺稳态中起关键作用，它能够主动将释放的Ca²⁺重新积聚回肌浆内质网，从而维持Ca²⁺稳态。细胞内Ca²⁺在控制细胞生长、分化和凋亡的多种信号通路中起关键作用^[16]。胰腺癌中，Ca²⁺/钙调神经磷酸酶/NFAT信号通路参与癌基因c-Myc的上调转录机制，导致G₁/S期转变加速，最终促进胰腺癌细胞的增殖^[17]。在某些乳腺癌中，存在特定钙可渗透离子通道的表达变化，这种变化可能在乳腺癌细胞的增殖和侵袭性中起重要作用，甚至与乳腺癌亚型及预后有关^[18]。研究^[19]表明，SERCA失调引起内质网钙储存池Ca²⁺的枯竭，进而导致细胞内钙水平上升。高胞质水平的Ca²⁺能够引起内质网应激反应，导致未折叠蛋白积累，启动细胞凋亡途径^[20]。研究发现，SERCA2在多种肿瘤中发挥促癌作用。本研究结果显示，经毒胡萝卜素处理后，卵巢癌细胞中SERCA2、BCL2、BCL-XL和SURVIVIN mRNA和蛋白表达水平均降低，细胞质中Ca²⁺浓度增加。提示毒胡萝卜素可有效抑制SERCA2的表达，促使Ca²⁺水平升高，降低抗凋亡蛋白Bcl2及Bcl-xl表达水平，进而引起卵巢癌细胞中的内质网应激和细胞凋亡。

本研究还发现，用毒胡萝卜素处理卵巢癌细胞后，CHOP mRNA及蛋白表达水平升高。CHOP也称为生长停滞和DNA损伤诱导基因153（growth arrest and DNA damage gene 153，GADD153），是内质网应激反应的特定转录因子，在正常条件下呈低表达水平，其上调能够诱导细胞生长停滞和凋亡^[21-22]。在胰腺癌细胞中，特异性siRNA诱导的CHOP表达下调显著降低了辣椒素诱导的细胞凋亡^[23]。因此，毒胡萝卜素可能通过激活CHOP诱导卵巢癌细胞凋亡。

VEGFA主要与2种酪氨酸激酶受体VEGFR1（Flt-1）和VEGFR2（KDR/Flk-1）结合，从而调节内皮细胞增殖、迁移和血管通透性，促进肿瘤血管生成^[24]。本研究发现，毒胡萝卜素可降低卵巢癌细胞VEGFA表达水平，抑制卵巢癌细胞的侵袭转移能力，提示毒胡萝卜素可能通过VEGFA抑制卵巢癌细胞的侵袭和转移。

综上所述，本研究结果表明，毒胡萝卜素能够抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭转移能力，并且可能通过调节SERCA2诱导卵巢癌细胞凋亡。