乳腺癌是威胁全球女性生命最主要的癌症之一。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一种具有特殊分子表型的乳腺癌亚型，其恶性度高且易发生转移，缺乏有效的治疗手段，患者预后差^[1]。因而，亟需探索针对TNBC的更有效的治疗方法。

血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）是近年来提出的一种全新的肿瘤微循环模式。不同于经典的内皮细胞依赖的肿瘤微血管结构，VM是高侵袭性肿瘤细胞为了满足自身的血供，通过自身变形和细胞外基质重塑而形成的一种类似血管样的通道^[2]。研究^[3]显示，TNBC中VM形成明显高于其他乳腺癌类型，其与TNBC的高侵袭性和转移性密切相关，也是导致抗血管生成药物疗效不佳的重要原因之一。因而，探索抑制VM的方法，将为TNBC的治疗提供新的思路。

microRNA-34a（miR-34a）是具有抑癌作用的微小RNA（microRNA，miRNA）之一，参与对细胞增殖、凋亡、衰老等多种生命活动的调控。近来研究^[4]显示，TNBC患者肿瘤组织中miR-34a表达水平极低，且miR-34a的低水平表达预示患者预后较差。本课题组前期研究^[5]显示，miR-34a过表达能够抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移活动，但其是否参与TNBC细胞VM形成的调控目前尚无报道。本研究以TNBC细胞MDA-MB-231为研究对象，通过体外三维培养模型，采用基因过表达、Western blotting等方法探讨miR-34a在TNBC细胞VM形成中的作用和机制。

1 材料与方法 1.1 材料

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人胚肾细胞株HEK293T（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心），胎牛血清（美国Gibco公司），RPMI 1640培养基、MEM培养基、胰蛋白酶（美国Hyclone公司），Matrigel胶（美国BD公司），磷酸盐缓冲液（北京索来宝生物科技有限公司），Taqman^® MicroRNA Reverse Transcription试剂盒（美国Applied Biosystems公司），RNA PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司），U6引物、miR-34a引物（美国Life Technologies公司），Trizol、转染试剂Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司），血管内皮细胞钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司），基质金属蛋白酶-2（matrix metalloprotease 2，MMP-2）抗体、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotease 9，MMP-9）抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（美国Cell Signaling Technology公司），E-cadherin抗体、Vimentin抗体（英国Abcam公司），miR-34a模拟物及其阴性对照（negative control，NC）、si-ZEB1及si-NC片段（上海吉玛制药技术有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实时定量PCR

用Trizol提取并测量细胞总RNA。使用Taqman法检测miR-34a的内源性表达，以U6作为内参，测量Ct值。以2^-ΔΔCt表示miR-34a的相对表达量。

1.2.2 细胞分组及转染

将MDA-MB-231细胞分为NC组、miR-34a组、si-NC组和si-ZEB1组。其中NC组转染miRNA无义序列，si-NC组转染siRNA无义序列，miR-34a组转染miR-34a模拟物，si-ZEB1组转染ZEB1 siRNA。取对数生长期的细胞，胰酶消化后700 g离心5 min，收集细胞，调整密度接种至6孔板。以Lipofectamine 2000为转染试剂，转染过程按照Lipofectamine 2000说明书进行。

1.2.3 细胞的三维培养

将预冷的Matrigel胶以50 μL/孔加至96孔板，小心摇动，使之均匀分布避免产生气泡。将包被好的96孔板37 ℃孵箱内1 h固化。细胞转染48 h后消化重悬，以2×104/孔种于Matrigel胶上，置于37 ℃孵箱内培养24 h后，倒置显微镜下观察、拍照、计数结点数，取每个视野均值，实验重复3次。

1.2.4 Western blotting法检测蛋白表达水平

细胞转染48 h后，提取各组细胞总蛋白，SDS/PAGE电泳，湿法转移法将蛋白转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗涤3次。一抗VE-cadherin（1:500）、MMP-2（1:1 000）、MMP-9（1:1 000）、E-cadherin（1:1 000）、Vimentin（1:1 000）4 ℃孵育过夜，HRP标记二抗（1:10 000）室温孵育1 h，孵育结束后TBST洗涤3次，每次间隔10 min。ECL发光显色，以GAPDH（1:1 000）为内参，检测蛋白表达水平。

1.2.5 双荧光素酶报告基因分析

将包含野生型miR-34a结合位点的ZEB1-wt- 3’非翻译区（untranslated region，UTR）及包含突变后miR-34a结合位点的ZEB1-mut- 3’UTR分别克隆入荧光素酶报告基因载体中构建质粒。将miR-34a模拟物或其NC与野生型或突变型报告基因质粒分别共转染入HEK293T细胞中。孵育48 h后，应用荧光素酶检测试剂盒检测荧光酶活性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，结果以x±s表示，组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 miR-34a过表达效果

miR-34a模拟物转染MDA-MB-231细胞48 h后，采用实时定量PCR检测miR-34a的表达水平，结果显示，与NC相比，转染miR-34a模拟物后，miR-34a表达水平上调（57.67 ± 8.74）倍（P < 0.05）。

2.2 过表达miR-34a对MDA-MB-231细胞VM形成的影响

MDA-MB-231细胞能够在三维培养条件下形成大小不等的网络样管腔结构。过表达miR-34a的MDA-MB-231细胞在Matrigel胶上形成的总节点数显著减少（P < 0.05），提示miR-34a能够显著降低MDA-MB-231细胞的VM形成能力。见图 1。

2.3 过表达miR-34a对VM形成相关分子标志物表达的影响

采用Western blotting检测2组细胞VM形成相关分子标志物的表达水平。结果显示，与对照组相比，过表达miR-34a的MDA-MB-231细胞中，VM形成标志物VE-cadherin、MMP-2及MMP-9的表达水平显著降低（P < 0.05），提示过表达miR-34a能够降低VM形成相关分子标志物的表达水平。见图 2。

2.4 miR-34a靶向结合ZEB1

应用miRanda (http://www.microrna.org/microrna/home.do)预测发现，miR-34a与ZEB1之间存在结合位点（图 3A）。双荧光素酶报告基因分析结果（图 3B）显示，ZEB1-wt-3’ UTR + miR-34a模拟物组荧光素酶活性较ZEB1-wt-3’ UTR + NC组显著下降（P < 0.05），而ZEB1-mut-3’ UTR + miR-34a模拟物组荧光素酶活性与ZEB1-mut-3’UTR + NC组相比无明显变化，证实miR-34a靶向抑制ZEB1表达。

2.5 沉默ZEB1对MDA-MB-231细胞VM形成的影响

si-ZEB1转染MDA-MB-231细胞后，采用三维培养观察VM形成变化。结果显示，与对照组相比，si-ZEB1组细胞VM形成显著下降（P < 0.05），提示ZEB1是参与MDA-MB-231细胞VM形成的重要调控因子。见图 4。

2.6 沉默ZEB1对MDA-MB-231细胞的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程的影响

采用Western blotting检测各组细胞EMT相关因子E-cadherin和Vimentin表达的变化。结果显示，沉默ZEB1后，E-cadherin表达显著增加，而Vimentin表达显著下降（P < 0.05），提示沉默ZEB1可抑制MDA-MB-231细胞的EMT进程。见图 5。

3 讨论

TNBC是临床上最具侵袭性的乳腺癌亚型之一。尽管TNBC的诊断和治疗已有较大进展，但由于该病易复发和转移，患者预后极差。VM是高侵袭性肿瘤细胞相互连接而形成的一种血管样通道。它能够为肿瘤细胞提供营养支持，使其获得更具侵袭性的表型，并能将肿瘤细胞带入微循环，从而转移到其他器官^[6]。多项研究证实，VM形成是促进TNBC肿瘤细胞侵袭和迁移的重要因素。

miRNA是一类长约18×10³~22×10³的非编码小RNA，它们能够诱导靶mRNA降解或抑制靶mRNA翻译，在转录后水平调控基因表达。一部分miRNA具有癌基因或抑癌基因的功能，与肿瘤的发生、发展和转移密切相关。近年来研究发现，miRNA与肿瘤VM形成的调控密切关联。LI等^[7]报道miR-141能够通过抑制EphA2的表达抑制胶质瘤的VM形成，WAN等^[8]报道miR-124能够通过靶向AmotL1在头颈部肿瘤中抑制VM形成。miR-34a是一种能够抑制肿瘤新生血管形成的miRNA^[9]，但其是否参与肿瘤细胞VM形成尚无研究报道。本研究以TNBC细胞MDA-MB-231为研究对象，通过体外实验首次发现，过表达miR-34a能够显著抑制MDA-MB-231细胞的VM形成，提示miR-34a可能为抑制TNBC细胞VM形成的重要因子。

越来越多的证据表明，EMT过程可以通过促进细胞的可塑性、重塑细胞外基质等机制促进VM形成，在恶性肿瘤的转移和VM形成中起到关键性作用^[10]。ZEB1是参与EMT调控的关键因子。临床研究^[11]发现，ZEB1高表达可作为预示TNBC患者低生存率的独立预后因子。近期研究发现，ZEB1参与肿瘤细胞的VM形成。LIU等^[12]的结肠直肠癌研究结果显示，VM阳性的样本中ZEB1表达上调且与EMT特征相关。敲低ZEB1能够减少VM形成，恢复肿瘤细胞的上皮表型，并抑制肿瘤的侵袭和迁移。本研究在TNBC细胞MDA-MB-231中观察到，沉默ZEB1能够显著减少VM形成，同时抑制肿瘤细胞的EMT过程，提示EMT调控关键因子ZEB1可作为抑制TNBC细胞VM形成的重要靶点。生物信息学分析显示，ZEB1是miR-34a的靶基因，且双荧光素酶报告基因分析结果显示，miR-34a能够靶向抑制ZEB1的表达。因此推测，miR-34a抑制TNBC细胞VM形成的机制可能与其靶向抑制ZEB1，抑制肿瘤细胞EMT过程有关。

综上所述，本研究首次发现miR-34a能够抑制TNBC细胞的VM形成，其机制可能与靶向ZEB1抑制EMT过程有关。本研究将为TNBC中抑制VM的治疗策略提供新的实验依据。