慢性牙周炎是由牙周菌斑微生物引起的炎症性疾病，其特点是牙周结缔组织破坏和牙槽骨吸收^[1-2]。慢性重度牙周炎是慢性牙周炎最为严重的一类，临床以牙周基础治疗作为最常规有效的治疗方法，但手术治疗后牙周组织仍有炎症，无法从根本上治愈^[3]。因此，研究慢性重度牙周炎的发生和发展机制，寻求治疗新方法是目前急需解决的问题。研究人员在慢性重度牙周炎患者的牙龈组织中发现大量的巨噬细胞浸润^[4-5]。巨噬细胞作为执行先天免疫的效应细胞，在牙周炎宿主对病原体的免疫应答中起重要作用^[6-7]。巨噬细胞由不同亚型的复杂细胞群组成，M2型巨噬细胞具有抑炎、抗寄生虫感染和组织修复的作用^[8]。然而，在慢性重度牙周炎的病损组织M2巨噬细胞如何表达，在其病程进展中发挥怎样的作用，目前国内尚未完全展开此类研究。本研究旨在通过检测M2巨噬细胞相关因子精氨酸酶Ⅰ（arginase1，Arg1）和STAT6在慢性重度牙周炎病损组织中的的表达情况，探讨M2巨噬细胞在慢性重度牙周炎的作用。

1 材料与方法 1.1 材料

Marker（美国赛默飞公司）；STAT6 Antibody（美国Cell Signaling公司）；Arg1 Antibody（美国Cell Signaling公司）；β-actin Antibody（中国Bioss公司）；Rabbit Anti-beta-Actin（Loading Control）（中国Bioss公司）；BCA蛋白测定试剂盒（增强型）（中国鼎国昌盛公司）；PVDF膜（美国GE公司）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（中国碧云天公司）；丽春红染色液（中国碧云天公司）；HiScript^®ⅡOne Step RT-PCR Kit（中国Vazyme公司）；100 bp DNA Ladder Marker（日本TaKaRa公司）；Trizol（美国Ambion公司）；STAT6引物合成（中国鼎国昌盛公司）；Arg1引物合成（中国鼎国昌盛公司）；DEPC水（中国鼎国昌盛公司）。

1.2 牙龈组织样本

收集2018年6月至12月于锦州医科大学附属第二医院牙周科与口腔颌面外科门诊被诊断为重度牙周炎且无保留意义需要拔除的患牙15例，将患牙牙龈组织样本作为实验组，收集15例埋伏阻生需要拔除的患牙，取阻生牙冠方覆盖的健康牙龈组织作为对照组^[9]。慢性重度牙周炎纳入标准：均符合中重度牙周炎诊断标准；口腔中剩余的牙齿≥20。排除标准：患有全身性疾病；有食物和药物过敏史；过去1年内进行过牙周治疗；最近2个月内服用过抗生素、非甾体类抗炎药和免疫抑制类药物；孕妇或正在使用避孕药的女性。所有患者签署知情同意书。本研究经锦州医科大学伦理委员会审核批准。

1.3 实时PCR检测

1.3.1 总RNA提取

Trizol法提取牙龈组织中的总RNA。紫外分光光度计测量RNA浓度，测定光密度（optical density，OD）值（260~280 nm均在1.8~2.2），记录提取的总RNA浓度。操作完成后，冻存于-80 ℃冰箱或直接进行PCR反应。

1.3.2 实时PCR反应

按照一步法反转录试剂盒配置25 μL反应体系，加入反应体系中RNA的量约为300 ng。反转录得到的cDNA进行PCR扩增。引物设计为Arg1引物序列：上游引物序列5’-CAAGGTGGCAGAAGTCAAG -3’，下游引物序列5’-GTCCAGTCCGTCAACATCAA-3’，扩增目的基因片段长度为466 bp。STAT6引物序列：上游引物序5’-GCCAAAGCCCTAGTGCTGAA-3’，下游引物序列5’-GACGAGGGTTCTCAGGACTTC-3’，扩增目的基因片段长度为231 bp。以β-actin为内参照物，上游引物序5’- AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，下游引物序列5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，扩增目的基因片段长度为285 bp引物均由北京鼎国昌盛生物科技有限公司合成。反应条件为94 ℃ 5 min；35个PCR循环（94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）；最后72 ℃延伸7 min。琼脂糖凝胶电泳分析：PCR反应产物10 μL，上样缓冲液1 μL，充分混匀后经2 %琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统内扫描，以β-actin的灰度值进行标准校正，计算Arg1和STAT6产物的相对量。

1.4 Western blotting检测

取适量牙龈组织，放入1.5 mL的EP管中，做好标记，加入150 μL裂解液，小剪刀尽量剪碎至无组织碎片，按照裂解液:蛋白酶制剂=100:1的比例，加入1.5 μL蛋白酶抑制剂，静置冰上30 min，每隔5 min涡旋1次，高速离心，4 ℃ 12 000 r/min离心25 min，取上清液至新EP管中（切勿吸到下层沉淀）。用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，经蛋白定量后按20 μg/孔行10%聚丙烯酰胺（10 %SDS-PAGE）电泳并经湿式转膜、洗膜、封闭（含5 %脱脂奶粉的TBST液），取一抗稀释液（TBST液）按照1:1 000稀释Arg1和STAT6抗体，4 ℃摇床过夜；洗膜后，再加入按照1:10 000稀释的二抗，室温振摇孵育2 h，充分洗膜，用ECL法显影、曝光后测量X线胶片上条带密度。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0对数据进行统计学分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用两独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 实时PCR结果

通过实时PCR比较健康对照组和慢性重度牙周炎组M2型巨噬细胞相关因子Arg1、STAT6的mRNA表达差异。在健康牙龈组织和慢性重度牙周炎病损组织中均有不同程度Arg1、STAT6 mRNA的表达，并且慢性重度牙周组Arg1、STAT6的mRNA的表达水平显著高于健康对照组，差异有统计学意义（P < 0.01），见图 1，表 1。

2.2 Western blotting检测结果

Western blotting检测健康牙周组织和慢性重度牙周炎病损组织Arg1和SATA6蛋白表达情况。在健康牙周组织和慢性重度牙周炎病损组织中均有Arg1和STAT6蛋白表达。与健康对照组相比，慢性重度牙周炎组中Arg1和STAT6蛋白表达水平增高，差异有统计学意义（P < 0.01），见图 2、表 2。

3 讨论

慢性重度牙周炎是一种以牙周组织破坏性为特征的慢性炎症性疾病^[10-12]。近年研究^[13]表明，慢性重度牙周炎进展可能与巨噬细胞密切相关。牙龈组织中的巨噬细胞作为宿主免疫的重要组成部分通过与牙周微生物相互作用，分泌大量的促炎细胞因子和趋化因子激活适应性免疫，参与牙周致病微生物的吞噬和炎症的产生。

巨噬细胞在多种细胞因子的影响下，可激活成替代活化的M2型。M2型巨噬细胞可以通过分泌抑制性细胞因子下调免疫应答，在组织愈合过程中分泌细胞外基质促进纤维变性和创伤修复。研究^[14]表明，信号转导和STAT6的磷酸化在巨噬细胞M2极化过程中具有重要作用。岳原亦等^[15]研究发现，STATs的活化在M2型巨噬细胞极化过程中占有不可忽视的地位。MISHRA等^[16]研究发现，野生型裸鼠的巨噬细胞M2极化水平比缺失了STAT6的实验裸鼠上升。SANSON等^[17]研究表明，在M2型巨噬细胞发生极化的过程中，高密度脂蛋白诱导巨噬细胞内的STAT6激活。CZIMMERER等^[18]研究发现在巨噬细胞M2极化过程中，活化的STAT6磷酸化抑制了调节转录程序启动子的表达。李连军等^[19]通过抑制STAT6磷酸化，从而抑制巨噬细胞分化为M2型，证实STAT6磷酸化是该过程中的关键调节途径。

此外，Arg1是M2型巨噬细胞释放的一种是位于细胞质中的稳定亲水性蛋白，具有抗炎、促进组织修复的作用。Arg1生成的鸟氨酸能够转化成多胺来调节创伤、愈合和细胞的增殖，Arg1还可以与iNOS竞争性地结合底物精氨酸，促进细胞分裂和胶原的形成，在炎症后期对由病原微生物造成的组织损伤进行修复和重塑^[20-21]。研究^[22]发现，在侵袭性牙周炎患者牙周组织中Arg1表达降低，SAWANO等^[23]也证实了这个观点，并发现Arg1具有促进血管生长和修复、重构损伤组织的功能。韩倩倩等^[24]通过分析牙龈组织中Arg1表达的变化，明确了炎症相关因子Arg1在牙周炎的慢性炎症过程中的重要作用。本研究结果显示，实验组重度慢性牙周炎病损组织中Arg1、STAT6的mRNA和蛋白表达水平高于对照组，表明M2型巨噬细胞相关因子Arg1、STAT6参与了慢性重度牙周炎病损组织的修复。在健康牙龈组织中也发现了Arg1、STAT6的存在，提示M2型巨噬细胞在维持组织的稳态中也具有关键性作用。

综上所述，在健康牙周组织和慢性重度牙周炎病损组织中均存在M2型巨噬细胞相关细胞因子Arg1和STAT6的表达，并且慢性重度牙周炎病损组织中M2型巨噬细胞细胞相关细胞因子的表达显著高于健康牙周组织，表明在慢性重度牙周炎中M2型巨噬细胞介导的免疫反应增强。但关于M2型巨噬细胞相关因子Arg1、STAT6在慢性重度牙周炎中的具体作用机制还有待研究。