胃癌是全球第四大常见癌症之一，其死亡率居全球癌症第二位，发病机制复杂且预后极差^[1]。现行的手术治疗、化疗和放疗疗效一般，胃癌防治策略研究迫在眉睫。多巴胺（dopamine，DA）作为重要的神经递质，在胃组织中大量存在，与认知、情绪、应激和运动有关^[2]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）被认为是恶性肿瘤中最重要的血管生成细胞因子^[3]。研究^[4]证实外源性DA可通过抑制血管生成导致肿瘤细胞凋亡，具有明显的抗肿瘤活性作用。运动与多巴胺能系统密切相关，游泳运动可以提高肝癌模型大鼠的DA水平，通过多巴胺D2受体（dopamine 2 receptor，D2R）显著抑制肝癌的生长和肺转移，延长生存时间^[4-5]。基于上述研究现状，本研究假设运动可能通过调节多巴胺能系统和肿瘤血管生成抑制胃肿瘤的生长，DA和运动干预可能有较好的抗肿瘤效应。本研究分析了DA和游泳运动对N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）诱导的胃癌大鼠生存率、肿瘤组织DA、血清DA及VEGF水平的影响，为胃癌的防治及术后康复提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 材料

160只4周龄雄性Wistar大鼠购自中国医科大学动物中心，体质量60~70 g。LC-6A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；TZD-CL-200S化学发光免疫分析仪（厦门天中达公司）；MNNG（日本东京化成工业株式会社）；盐酸多巴胺、多潘立酮、高氯酸、谷胱甘肽、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钾和氯化钾、二甲基亚砜（美国Sigma-Aldrich公司）；ELISA试剂盒（上海市恒远生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作

所有Wistar大鼠先进行1周的适应性游泳训练，游泳水槽体积60 cm×50 cm×50 cm，水深25 cm，水温34 ℃左右，环境温度为（22±4.1）℃，光照周期12 h:12 h，湿度55%±4%。二甲基亚砜作为溶剂，将MNNG配成20 %的溶液，加蒸馏水稀释至80 mg/L，置于4℃冰箱中避光保存，将MNNG溶液作为160只4周龄雄性Wistar大鼠的日常饮用水，持续28周，然后停止MNNG溶液喂养，饮用正常蒸馏水持续22周，共50周。随机选取并标记10只大鼠，用于造模及成瘤分析，10只标记大鼠无死亡情况，采用颈椎脱位的方式处死标记大鼠，发现8只大鼠出现胃肿瘤（肿瘤发生率80%），分离肿瘤组织后用微卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积（1.56±0.47）mm（按肿瘤直径计算），提示造模成功，可进行后续实验。

1.2.2 大鼠分组及干预方案

将剩余存活的129只（造模过程中死亡21只）MNNG诱导50周的Wistar胃癌大鼠称重，选取体质量相差在9.5 g以内的100只大鼠，随机分为A、B组（每组50只）。A、B 2组再分别随机分为5组（每组10只）：肿瘤对照（Ca）组、游泳组（Sw）、DA组、DA+多潘立酮（DA+DP）组、游泳+DA（Sw+DA）组。Ca组不进行特殊干预，正常饮食休息，Sw组每天进行2次共60 min（中间休息5 min）的游泳运动，每周运动5 d。DA组每天腹腔注射DA（50 mg/kg）。DA+DP组在DA注射前给予多潘立酮（10 mg/kg，灌胃）。Sw+DA组每天游泳后注射DA。大鼠每次游泳运动结束后均及时吹干，避免着凉。观察A组大鼠的死亡情况，每天记录死亡数量，直到A组大鼠全部死亡，用于生存率分析。B组干预6周后，用静脉穿刺法抽取血液，处死所有存活大鼠，分离胃肿瘤组织冷藏备用，用于测定血清DA、VEGF水平、肿瘤组织DA水平以及肿瘤体积变化情况。本研究实验动物的利用符合中国医科大学动物伦理委员会的规定。

1.2.3 DA水平测定

采用高效液相色谱-电化学检测法对血清和胃肿瘤组织进行DA检测。将肿瘤组织称重，加入10.2 mL的0.6 mol/L高氯酸中匀浆，高氯酸中含有1.7 mg/mL乙二醇四乙酸和1.1 mg/mL还原性谷胱甘肽，0 ℃ 2 500 g离心15 min，上清1.0 mL，加入6 mol/L氢氧化钾调pH至8.6，分批萃取后进行DA浓度测定。在25 µL氯化钾（3 mol/L）中加入200 µL高氯酸（0.2 mol/L）洗脱液，离心，取上清液，将50 µL上清液注入高效液相色谱系统。抽取后的血液立即置于真空促凝采血管中，4 ℃冷藏柜保存1 h后离心（3 000 r/min，15 min）取200 µL血清放入匀浆器，加入200 µL流动相和10 µL蛋白沉淀剂复溶，涡旋混合后，高速离心（12 000 r/min）10 min，取上清液，进样50 µL。在上清液中，DA的灵敏度极限为0.01 ng/mL，定义为基线噪声的2倍，如果浓度低于灵敏度极限，DA的浓度赋值为0。

1.2.4 血浆VEGF水平检测

血样以800 r/min，4 ℃离心30 min，3 000 r/min离心10 min，收集血浆，80 ℃保存，根据制造商的方案，采用ELISA法测定血浆VEGF水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据以x±s表示，单因素方差分析比较5个实验组间的差异，Bonferroni检验进行事后两两比较。生存率用Kaplan-Meier方法计算，用log-rank进行显著性检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 DA和游泳运动对胃癌大鼠生存率的影响

63 d DA和游泳运动干预后，Sw+DA组生存率明显高于Ca组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 1。

2.2 DA和游泳运动对胃癌大鼠肿瘤生长情况、肿瘤组织DA水平、血清DA和VEGF水平的影响

42 d DA和游泳运动干预后，与Ca组大鼠比较，DA、Sw+DA组大鼠胃肿瘤体积明显缩小，血清和肿瘤组织DA水平明显升高（均P < 0.05），Sw、DA、Sw+DA组大鼠血清VEGF水平明显降低（P < 0.05）；与Sw组比较，DA、Sw+DA组肿瘤体积明显缩小，血清和肿瘤组织DA水平明显升高（均P < 0.05），Sw+DA组血清VEGF水平明显降低（P < 0.05）；与DA组比较，DA+DP组肿瘤体积明显增大，血清和肿瘤组织DA水平明显降低，VEGF水平明显升高（均P < 0.05），而Sw+DA组结果相反，肿瘤体积缩小，DA水平升高，VEGF水平降低（均P < 0.05）。见表 1。

2.3 单一游泳运动、DA及游泳运动对胃癌大鼠血清DA、VEGF水平的长期影响

与基线比较，单一游泳运动后VEGF水平逐渐降低，42 d时出现统计学差异（P < 0.05）；DA及游泳运动干预后，与基线比较，DA水平逐渐升高，14 d、28 d、42 d时出现统计学差异（均P < 0.05），VEGF水平逐渐降低，28 d、42 d时出现统计学差异（均P < 0.05），见图 2。

3 讨论

胃癌生存率低且预后极差，是全球癌症死亡的主要原因之一^[6]，由于该病的早期无特异性症状，多数患者确诊时已处于晚期，目前治疗方法主要是手术及术后放、化疗且疗效一般^[7]，有关胃癌的防治策略研究一直是学者关注的重点。

DA是一种安全有效的药物，外源性DA可通过D2受体抑制肿瘤细胞增殖^[8]，广泛应用于食管癌、胃癌等消化系统肿瘤中，具有明显的抗肿瘤活性作用^[4]。DA主要通过5种不同的G蛋白偶联受体亚型对靶细胞发挥作用，根据其药理特性分为D1和D2类受体，D1类包括D1R和D5R，D2类包括D2R、D3R和D4R^[9]。内源性DA在调节胃的生理机能中发挥重要作用，如减少胃酸分泌、刺激碳酸氢盐产生和黏液的分泌。研究^{[2, 10]}发现，D2R与肿瘤有关，在人类胃癌、膀胱癌和肝癌细胞中，DA和D2R水平明显降低，DA与癌症呈负相关。肿瘤血管生成对实体肿瘤的生长和发展至关重要，VEGF被认为是恶性肿瘤中最重要的血管生成细胞因子^[3]，且受到D2受体的调控，VEGF过表达与肿瘤生长、微血管密度、增殖、转移及预后有关^[11]。研究^[12]表明，VEGF及其受体VEGFR-2介导的血管生成信号传导通路在胃癌的发生发展中起重要作用。DA主要通过D2R抑制VEGF，进而抑制肿瘤组织血管生成和癌细胞的发展转移，最终提高机体的生存率^[4]，本研究通过MNNG诱导建立雄性Wistar大鼠胃癌模型，采用腹腔注射DA和多潘立酮灌胃的方式干预6周，发现DA可上调胃癌大鼠血清和癌组织中的DA水平，降低VEGF水平，多潘立酮几乎完全阻断了DA对胃癌的抑制作用，表明DA可通过D2R特异性地抑制VEGF介导的血管生成，抑制胃癌细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，最终提高其生存率。

近年来，运动疗法在癌症预防和术后康复中逐渐受到重视，运动不但可以减少不同类型恶性肿瘤的发病风险，还能抑制肿瘤增殖和转移，延长生存时间^[13-15]。研究^[4]发现，运动对肿瘤的抑制作用可能与多巴胺能系统有关，运动通过激活肿瘤细胞D2R信号，使得外周血中DA水平上调，最终抑制癌细胞的发生和转移。另外，运动可以下调结直肠癌、乳腺癌、肺癌VEGF表达，抑制肿瘤血管生成，促进肿瘤细胞凋亡^[16-17]。因此推测运动可能通过调节多巴胺能系统和肿瘤血管生成来抑制胃癌发展，DA及运动干预可能是胃癌防治的有效策略。本研究结果显示，DA及运动共同作用可提高胃癌大鼠DA水平，降低VEGF水平，抑制胃癌细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，有效延长胃癌大鼠的生存时间。单一DA疗法可上调胃癌大鼠DA水平，下调胃癌大鼠VEGF水平，提高生存率，但效果低于运动与DA的共同作用。单一游泳运动可降低胃癌大鼠血清VEGF水平，但对大鼠的生存率和DA水平无影响，说明游泳运动对抑制胃癌血管形成有一定作用，但对抑制胃癌大鼠肿瘤组织生长、提高生存时间作用不明显。DA与游泳运动共同作用比单纯DA、游泳运动对胃癌有更强的抑制作用，提示运动可作为胃癌治疗的辅助手段，可加强DA对胃癌的抑制。此外，为了分析DA及运动对胃癌大鼠血清DA和VEGF水平的长期影响，分别在基线、7 d、14 d、28 d、42 d检测了大鼠血清DA和VEGF水平，发现单纯游泳运动持续降低胃癌血清VEGF水平，但对血清DA水平影响不明显。运动与DA共同作用对血清DA和VEGF水平有持续影响，可升高血清DA水平（14 d起效），降低血清VEGF水平（24 d起效）。

本研究发现，DA及其受体D2R可抑制胃癌大鼠血管生成，证明了DA作为胃癌药物治疗的可行性，D2R可能作为一个新的胃癌治疗的潜在靶点，值得深入研究。本研究中，虽然单一游泳运动对胃癌大鼠DA和肿瘤生长未产生明显影响，但运动干预作为一种辅助治疗方式，值得在肿瘤防治中深入探索。

综上所述，DA及运动干预可抑制胃癌大鼠肿瘤细胞的发生发展，提高其生存率。其效果优于单一的DA注射或者运动干预，运动可能作为一种有效的胃癌药物治疗辅助手段。DA可通过D2R特异性地抑制VEGF介导的血管生成，诱导肿瘤细胞凋亡，DA及其受体D2R可作为胃癌治疗新的潜在靶点，值得进一步探索。