胰腺癌是一种恶性程度高、诊治困难的恶性肿瘤, 其中85%为起源于胰腺导管上皮的胰腺腺癌。胰腺癌的发病率和死亡率近年来明显上升, 据统计, 2015年胰腺癌已在全球范围内造成411 600人死亡^[1-2]。胰腺癌侵袭性强, 1年生存率和5年生存率分别为25%和5%, 是预后最差的恶性肿瘤之一^{[1, 3]}。胰腺癌初期多无明显症状, 待肿瘤增大导致胆管梗阻或转移后, 才可能因黄疸、疼痛等症状而被确诊。多数患者手术风险大, 围术期死亡率较高, 且仅有20%的患者就诊时具备手术指征, 多数患者确诊时已丧失手术时机^[4]。另一方面, 患者对放化疗等辅助治疗反应率低, 术后短期内常出现复发或进展。因此, 寻求合理有效、以延长生存期及提高生存质量为主的综合治疗是目前研究的重点。

吉西他滨是一种脱氧胞苷类似物, 属嘧啶类, 是细胞周期特异性抗肿瘤代谢类药物, 主要作用于S期细胞, 抑制DNA合成, 并可阻止细胞由G₁期进入S期。经美国食品药品监督管理局许可及美国国立综合癌症网络指南认证, 目前已广泛作为胰腺癌患者一线化疗用药^[5-6]。目前吉西他滨治疗方案用于胰腺癌已成为临床共识, 但单药治疗收益有限, 合并5-氟尿嘧啶等其他化疗药物及厄洛替尼等靶向药物亦反应率低, 且不良反应大, 尚无有效证据明显延长生存时间及总生存率, 生存质量亦无明显提升。因此, 寻求合理的辅助治疗方法及药物迫在眉睫。香菇多糖是从菌类香菇中分离得到的具有β-1, 6支链和β-1, 3支链的葡聚糖^[7], 是一种常用的免疫调节剂, 具有免疫激活和抗肿瘤活性^[8], 在临床上已广泛用于胃癌、食管癌、肺癌、血液系统肿瘤的辅助治疗。它能够减少化疗不良反应, 提高免疫系统活性, 改善生活质量。这可能与用药后免疫应答增强, 及其自身化学结构影响肿瘤细胞增殖、凋亡、能量代谢等生物学活动有关^[9]。

目前, 针对香菇多糖和吉西他滨联合用药抑制胰腺癌的研究尚无报道。因此, 本研究使用人转移性胰腺癌细胞系ASPC-1为研究对象, 探讨不同给药方式对胰腺癌细胞生物学行为的影响, 为临床更好地治疗胰腺癌提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞株

ASPC-1人转移性胰腺癌细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂

RPMI 1640培养基(美国GIBCO公司); 胎牛血清、胰蛋白酶(美国Hyclone公司); 吉西他滨(法国Lilly公司); 香菇多糖(大连金港药业有限公司); MTT试剂盒、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司); 兔抗survivin (英国Abcam公司); RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 细胞培养

人胰腺癌细胞ASPC-1接种于RPMI 1640培养液中, 内含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺, 置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。常规传代, 取对数生长期细胞用于实验。

1.3 MTT

铺板, 消化, 收集对数生长期ASPC-1细胞, 5% RPMI 1640培养液配成单细胞悬液, 以5 000/μL密度接种于96孔板, 培养过夜后, 分为5组并加药。吉西他滨单药组:分别加入1、12.5、25、50、200、400 μg/mL的吉西他滨; 香菇多糖单药组:分别加入1、10、20、40、80、160、320 μg/mL的香菇多糖; 吉西他滨+香菇多糖联合用药组:加入吉西他滨和香菇多糖的浓度分别1 μg/mL和1 μg/mL、12.5 μg/mL和10 μg/mL、25 μg/mL和20 μg/mL、50 μg/mL和40 μg/mL、100 μg/mL和80 μg/mL、200 μg/mL和160 μg/mL、400 μg/mL和320 μg/mL。每个浓度均设5个复孔, 同时设置空白对照组(不加细胞, 加入等量的培养基)和阴性对照组(加入等量0.1% DMSO溶液)。5%CO₂培养箱中培养24和48 h。之后每孔加25 μL MTT (5 mg/mL), 培养箱中继续孵育4 h, 吸净培养液加入150 μL DMSO, 振荡10 min, 使生成的紫色结晶充分溶解。孵育2 h后, 使用酶标仪检测波长为490 nm的吸光值, 计算药物对细胞的抑制率, 抑制率(%) =1- (OD_实验组-OD_空白组) / (OD_对照组-OD_空白组) ×100。所有实验均独立重复3次。

1.4 流式细胞术

将细胞分为4组:吉西他滨单药组(吉西他滨浓度为24 h时的IC50, 即50 μg/mL)、香菇多糖单药组(香菇多糖浓度为80 μg/mL)、吉西他滨+香菇多糖联合用药组(吉西他滨浓度为50 μg/mL, 香菇多糖浓度为80 μg/mL), 同时设立阴性对照组(加入等体积PBS)。培养过夜, 常规消化收集细胞, 稀释至1.5×10⁵/mL的细胞悬液, 6孔板中每孔加入l mL细胞悬液, 予以药物干预, 置培养箱中培养。培养24 h后, 收集各组培养液, 胰酶消化收集细胞, 1 000 r/min离心5 min, 沉淀细胞后, 用预冷的PBS洗涤细胞2次(1 000 r/min离心5 min)。用200 μL结合缓冲液重悬细胞, 加入5 μL Annexin V-FITC混匀间隔4 min后, 加入10 μL PI (20 μg/mL)染液, 室温避光孵育10 min后, 用流式细胞仪检测细胞凋亡情况(激发波长480 nm, 吸收波长630 nm)。

1.5 Western blotting

细胞分为4组:吉西他滨单药组(吉西他滨浓度为50 μg/mL); 香菇多糖单药组(香菇多糖浓度为80 μg/mL); 吉西他滨+香菇多糖联合用药组(吉西他滨浓度为50 μg/mL, 香菇多糖浓度为80 μg/mL); 阴性对照组(加入等体积PBS)。经药物处理24 h后提取细胞总蛋白, 用BCA法测定蛋白浓度, 上样量20 μg, 1:1加入上样缓冲液后SDS-PAGE电泳, 100 V转移3 h至PVDF膜, 放入封闭液中37 ℃封闭1 h, 加入一抗(1:2 000稀释) 4 ℃孵育过夜, 洗膜后, 二抗(HRP标记羊抗兔IgG, 1:20 000稀释)孵育1 h; 化学发光后显影。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件分析数据。每个时间点组间比较采用单因素方差分析, 两两比较采用t检验; 率的两两比较采用χ²检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 MTT检测药物作用后细胞增殖抑制率

吉西他滨单药组和香菇多糖单药组中, 药物作用24、48 h后, ASPC-1细胞生长明显抑制。吉西他滨单药组中, 吉西他滨浓度为50 μg/mL时, 24和48 h时ASPC-1细胞生长抑制率分别为48.3%和53.5%, 呈时间依赖性。见图 1A。香菇多糖单药组中, 香菇多糖浓度为40 μg/mL时, 24和48 h时ASPC-1细胞生长抑制率分别为31.3%和39.9%, 呈时间依赖性。但当香菇多糖浓度达到80 μg/mL以上, 继续增加药物浓度, 抑制作用无明显增强, 320 μg/mL时的抑制率与80 μg/mL比较无统计学差异(P > 0.05)。见图 1B。吉西他滨+香菇多糖联合用药组ASPC-1增殖抑制率明显上升, 与吉西他滨单药组比较差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 2。

2.2 Annexin-V FITC/PI双标记染色法检测细胞凋亡情况

使用Annexin-V FITC/PI双染检测细胞凋亡情况, 流式细胞术所得的FITC/PI荧光双染散点图中, 左下象限(Q3)为正常细胞, Annexin-V FITC (-)、PI (-); 左上象限(Q1)为坏死细胞Annexin-V FITC (-)、PI (+); 右上象限(Q2)为晚期凋亡细胞和死细胞, Annexin-V FITC (+)、PI (+); 右下象限(Q4)为早期凋亡细胞, Annexin-V FITC (+)、PI (-)。以Q2+Q4细胞数计算各组凋亡率, 阴性对照组为(9.07±0.82) %, 香菇多糖单药组为(15.41±2.30) %, 吉西他滨单药组为(33.12±3.90) %, 吉西他滨+香菇多糖联合用药组为(50.41±3.32) %。吉西他滨+香菇多糖联合用药组ASPC-1细胞的凋亡率高于吉西他滨单药组, 差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 3。

2.3 Western blotting检测凋亡抑制蛋白survivin表达情况

与对照组比较, 药物处理后survivin蛋白表达均有不同程度下降; 吉西他滨+香菇多糖联合用药组较吉西他滨单药组survivin蛋白表达下降更明显, 差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 4。

3 讨论

目前胰腺癌的化学治疗仍以吉西他滨为首选, 但晚期肿瘤患者预后差, 治疗反应率低^[10]。因此, 寻求有效的联合治疗方案是亟待解决的研究重点。目前, 各种免疫治疗、生物治疗均在尝试阶段, 尚未形成共识。香菇多糖是一种具有免疫调节作用的抗肿瘤辅助药物, 从香菇子实体或菌丝中提取, 具有抗肿瘤、免疫调节等多种生物学作用。研究证实, 香菇多糖能够通过刺激机体的免疫器官、促进淋巴细胞的增殖分化、增加自然杀伤细胞活性、在基因和分子层次上促进免疫功能的表达, 以恢复机体的免疫功能和肿瘤微环境中的免疫平衡。香菇多糖还是一种T细胞激活剂, 进入人体后能促进T细胞增殖, 增加白细胞介素的释放, 诱导T细胞产生具有免疫活性的细胞因子, 增强体内自然杀伤细胞活性, 对肿瘤细胞起到杀伤作用。香菇多糖还能促进单核-巨噬细胞系统的活性, 增强抗体依赖的细胞毒作用, 发挥抗肿瘤作用^[11-12]。目前, 香菇多糖主要是作为一种免疫调节剂应用于临床, 对胃癌、肝细胞癌、结肠癌、肺癌等具有明显疗效^[13-17], 也有研究^[18]报道其用于进展期胰腺癌有效, 但经验依旧匮乏。Zhang等^[19]报道香菇多糖在改善生活质量以及在癌症治疗期间促进化学疗法和放射疗法的疗效中具有坚实作用, 可能的作用机制包括通过多种信号通路(如TLR4/Dectin1-MAPK和Syk-PKC-NF-κB通路)激活免疫细胞。国内也有学者报道, 香菇多糖辅助化疗治疗晚期结直肠癌的疗效显著, 能有效改善患者免疫功能, 还能有效控制转移、浸润及新生血管形成。这些研究证明香菇多糖可明显改善免疫功能, 提高生活质量, 并且安全, 无明显不良反应, 是一种良好的免疫佐剂。

本研究探讨了吉西他滨联合香菇多糖对人转移性胰腺癌细胞ASPC-1的增殖抑制作用和诱导凋亡作用。结果显示, 两药联合使用时对ASPC-1细胞的抑制作用和诱导凋亡作用明显增强, 凋亡抑制蛋白survivin表达下降, 联合用药效果优于吉西他滨单药治疗。香菇多糖可以作为一种辅助治疗药物用于胰腺癌的治疗, 对吉西他滨起到增效、增敏的作用, 从而改善抗肿瘤治疗效果, 但具体作用机制尚不完全明确。且大样本临床研究结果仍然匮乏, 相信随着研究的不断深入, 其作用机制和治疗效果会被逐渐揭晓。