中国医科大学学报  2020, Vol. 49 Issue (3): 198-202, 208

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于冬冬, 赵丹阳, 杨鸫祥, 杨关林
YU Dongdong, ZHAO Danyang, YANG Dongxiang, YANG Guanlin
辛伐他汀通过NF-κB通路抑制破骨细胞的分化
Simvastatin inhibits osteoclast differentiation through the NF-κB pathway
中国医科大学学报, 2020, 49(3): 198-202, 208
Journal of China Medical University, 2020, 49(3): 198-202, 208

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收稿日期：2018-09-03
网络出版时间：2020-03-17 9:39
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于冬冬, 赵丹阳, 杨鸫祥, 杨关林. 辛伐他汀通过NF-κB通路抑制破骨细胞的分化[J]. 中国医科大学学报, 2020, 49(3): 198-202, 208.
YU Dongdong, ZHAO Danyang, YANG Dongxiang, YANG Guanlin. Simvastatin inhibits osteoclast differentiation through the NF-κB pathway[J]. Journal of China Medical University, 2020, 49(3): 198-202, 208.
辛伐他汀通过NF-κB通路抑制破骨细胞的分化
于冬冬1 , 赵丹阳2 , 杨鸫祥1 , 杨关林3     
1. 辽宁中医药大学附属医院骨科, 沈阳 110032;
2. 沈阳市第一人民医院神经内科, 沈阳 110041;
3. 辽宁中医药大学附属医院中西医结合内科, 沈阳 110032
收稿日期：2018-09-03；网络出版时间：2020-03-17 9:39
基金项目：国家自然科学基金(81973719)；辽宁省自然科学基金(20170540597)；辽宁省教育厅科学技术研究项目(L201921)；辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室开放基金(zyzx1908)
作者简介：于冬冬(1983-), 男, 副主任医师, 博士.
通信作者：杨关林, E-mail:guanlinyang@yeah.net.
摘要：目的 探讨辛伐他汀抑制破骨细胞分化的机制。方法 RAW264.7细胞培养并传代，sRANKL+M-CSF诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化；WST-1检测不同浓度辛伐他汀对破骨细胞增殖活性的影响；TRAP染色检测辛伐他汀对破骨细胞分化的影响；免疫荧光检测辛伐他汀对破骨细胞肌动蛋白环形成的影响及对通路蛋白p65细胞核内转移的影响；Western blotting检测加入辛伐他汀后对通路蛋白p65的影响。结果 WST-1结果显示，辛伐他汀(10-6 mol/L)作用24 h后明显抑制了破骨细胞的增殖活性。TRAP染色显示，成熟的破骨细胞增多核，胞浆嗜酸性，染色呈酒红色，加入辛伐他汀及核因子κB(NF-κB)通路抑制PDTC后，破骨细胞的形成及分化明显受到抑制。免疫荧光检测显示，辛伐他汀抑制破骨细胞肌动蛋白环的形成、抑制NF-κB信号通路核心蛋白p65的细胞核内转位。免疫印迹结果显示，辛伐他汀能够抑制p65的磷酸化。结论 辛伐他汀通过NF-κB信号通路抑制破骨细胞的分化。
关键词：辛伐他汀    绝经后骨质疏松症    破骨细胞分化    
Simvastatin inhibits osteoclast differentiation through the NF-κB pathway
YU Dongdong1 , ZHAO Danyang2 , YANG Dongxiang1 , YANG Guanlin3     
1. Department of Orthopedics, The Affiliated Hospital, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, China;
2. Department of Neurology, The First People's Hospital of Shenyang, Shenyang 110041, China;
3. TCM Internal Medicine, The Affiliated Hospital, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, China
Abstract: Objective To explore the mechanism through which simvastatin inhibits osteoclast differentiation. Methods RAW264.7 cells were cultured and passaged, and sRANKL+M-CSF was added to induce RAW264.7 cell differentiation into osteoclasts. WST-1 assay was used to detect the effects of simvastatin on the proliferation of osteoclasts exposed to different concentrations of sRANKL+M-CSF. The effect of simvastatin on osteoclast differentiation was detected by TRAP staining. The effects of simvastatin on F-actin ring formation in osteoclasts and nuclear translocation of the nuclear factor kappa B (NF-κB) pathway protein p65 were assessed by immunofluorescence. The effect of simvastatin on p65 protein expression was assessed by western blotting. Results WST-1 assay showed that simvastatin (10-6 mol/L) significantly inhibited osteoclast proliferation after 24 h. TRAP staining showed that mature osteoclasts were nucleocytic, with eosinophilic cytoplasm that stained a wine red color. Adding simvastatin together with PDTC (an inhibitor of the NF-κB pathway) noticeably inhibited formation and differentiation of osteoclasts. Immunofluorescence assays showed that simvastatin inhibited the formation of actin rings in osteoclasts, and inhibited nuclear translocation of the core protein p65 of the NF-κB signaling pathway. Western blotting revealed that simvastatin could inhibit p65 phosphorylation. Conclusion Simvastatin inhibits osteoclast differentiation through the NF-κB pathway.
Keywords: simvastatin    postmenopasal osteoporosis    osteoclast differentiation    

绝经后骨质疏松症(postmenopasal osteoporosis, PMOP)是最常见的原发性骨质疏松症。在PMOP的发病过程中, 破骨细胞过度活化同时伴随过度骨吸收[1]。临床目前应用的防治PMOP药物都存在一定程度的不良反应, 而且没有一种抗骨质疏松药物能够完全恢复丢失的骨量[2]。

他汀类药物是临床治疗高脂血症的常用药物[3]。研究[4]发现, 他汀类药物影响破骨细胞的分化及骨吸收, 但具体的作用机制尚不明确。本研究试图阐明辛伐他汀对破骨细胞分化调节及其潜在机制, 为临床防治PMOP提供新思路及研究依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞

小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7 (美国ATCC公司)。

1.1.2 试剂

辛伐他汀(Simvastatin, SIM, 美国Sigma公司。溶于无水乙醇, 储存浓度10-2 mol/L, -20℃保存); 重组人可溶性RNAK配体(recombinant human soluble RANK Ligand, sRANKL, 美国Peprotech公司); 重组人巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human macrophage colony stimulating factor, M-CSF, 美国Peprotech公司); DMEM (美国Hychone公司); 胎牛血清(美国Hychone公司); TRAP染色试剂盒(美国Sigma公司); 核因子κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)免疫荧光检测试剂盒(中国Beyotime公司); WST-1检测试剂盒(中国Beyotime公司); p65、p-p65一抗(美国Cell signaling公司); 鬼笔环肽检测试剂(美国AAT BiBe Questy公司)。

1.1.3 仪器

细胞孵箱(美国Thermo公司); 倒置相差显微镜(日本Olympus公司); 免疫荧光显微镜(日本Olympus公司); 流式细胞仪(美国BD公司); AMR-100酶标仪(中国杭州奥盛仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7培养及诱导分化

RAW 264.7细胞在DMEM未分化培养基中培养(含10%胎牛血清、不含抗生素、37℃、5%CO2孵箱内培养, 注意调节培养基的pH值, 宁偏酸性勿碱性)。细胞接种于10 cm2培养板内, 细胞传代可用胰酶, 但一定要注意控制胰酶消化的时间。也可以用无菌枪头把细胞从贴壁的状态直接吹打成悬浮细胞。诱导分化培养基(DMEM、10%胎牛血清、15 ng/mL sRANKL、15 ng/mL M-CSF)继续培养7 d。

1.2.2 WST-1检测细胞增殖活性

研究分为对照组、10-5~10-9 mol/L的SIM组。细胞以5×103/孔平铺于96孔平板中, 24 h后更换诱导分化培养基, 诱导培养基培养7 d后, 细胞经SIM处理3、12、24、48 h, 每孔加20 μL WST-1检测剂。在孵箱中孵育1 h。450 nm读取吸光度值。光密度(optical delnsity, OD)值= (处理后细胞OD值-对照组细胞OD值/N), n > 3。

1.2.3 TRAP染色检测破骨细胞分化

诱导分化培养基中加入不同浓度的sRANKL+M-SCF (0、5 ng/mL、15 ng/mL、50 ng/mL)诱导分化7 d。TRAP染色根据Sigma试剂盒进行操作。分析SIM对成骨细胞分化影响的分析共分5组, 分别为A组(对照组)、B组(sRANKL+M-SCF组)、C组(SIM+sRANKL+M-SCF组)、D组(PDTC+sRANKL+M-CSF)、E组(SIM+PDTC+sRANKL+M-CSF)。RAW264.7细胞(5×104/孔)在24孔板内培养, 在含和不含SIM (10-6 mol/L)的条件下进行诱导分化培养及药物干预。

1.2.4 肌动蛋白检测破骨细胞吸收活性

吸收活性检测分为4组。A组(对照组)、B组(sRANKL+M-SCF组)、C组(SIM+sRANKL+M-SCF组)和D组(PDTC+sRANKL+M-CSF组)。RAW264.7细胞(5×104细胞/孔)在24孔板内培养, 在含和不含SIM (10-6 mol/L)的条件下诱导分化7 d。用免疫固定液在室温下固定15 min, 用免疫洗涤液(含0.1%的Triton X-100)在冰上冲洗3 min后, 用鬼笔环肽检测试剂染色40 min, 用DAPI溶液染色细胞核5 min。使用共焦显微镜拍照。使用滤光器鬼笔环肽检测试剂(激发:492 nm; 发射:518 nm)。

1.2.5 免疫荧光检测NF-κB核转位

免疫荧光检测共分为4组。A组(对照组)、B组(sRANKL+M-SCF组)、C组(SIM+sRANKL+M-SCF组)、D组PDTC+sRANKL+M-CSF组。细胞在盖玻片上并培养过夜, 在含和不含SIM (10-6 mol/L)的条件下诱导分化7 d。细胞固定后, 用p-p65抗体孵育细胞(以1:400的比例稀释)过夜, 用DAPI染色细胞核(5 min), 免疫荧光显微镜检测。

1.2.6 Western blotting检测

分别用sRANKL+M-SCF和SIM+sRANKL+M-SCF进行处理。细胞在含和不含SIM (10-6 mol/L)的条件下诱导分化7 d。提取蛋白, 定量, 上样, 蛋白电泳, 转膜, 封闭, 一抗孵育过夜, 二抗标记, ECL发光法曝光成像。Image J软件测定平均灰度值, 与内参值进行标准化后进行统计分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析, 数据以x±s表示, 采用ANOVA检验, P < 0. 05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 SIM抑制RAW264.7细胞增殖活性

采用WST-1方法对RAW264.7细胞增殖活性进行检测, 结果显示, SIM (10-5 mol/L、10-6 mol/L)均能抑制破骨细胞的增殖活性, 但是SIM (10-6 mol/L)作用24 h、48 h能稳定抑制RAW264.7细胞的增殖活性。因此, SIM (10-6 mol/L)作用24 h作为实验用药浓度及作用时间。见表 1。

表 1 SIM对RAW264.7细胞增殖活性的影响(x±s, n = 6) Tab.1 Effect of SIM on RAW264.7 cell proliferation (x±s, n = 6)
Group Time of SIM (h)
24 h 48 h
Control 1.4±0.01 1.3±0.01
SIM 10-5 mol/L 0.8±0.011) 1.2±0.031)
SIM 10-6 mol/L 0.9±0.021) 1.1±0.011)
1) compared with control group, P < 0.05.
表选项

2.2 破骨细胞的形态学观察

未分化的RAW264.7细胞呈圆形, 透光度好, 边界清晰。加入诱导液后, 细胞触角逐渐增多, 细胞略呈短梭形, 细胞透光度下降, 继而细胞融合成巨大的多核破骨细胞(细胞核数≥3) (B组破骨细胞数量44%±0.15%), 加入SIM (C组破骨细胞数量18%±0.12%, P = 0.004)及PDTC (D组破骨细胞数量33%±0.23%, P = 0.034)后, 破骨细胞的分化受到抑制, 融合的破骨细胞数量明显减少, SIM+PDTC组(E组破骨细胞数量21%±0.12%, P = 0.064)的作用效果与单独SIM组及PDTC相似。见图 1。

A, control group; B, sRANKL+M-CSF group; C, SIM+sRANKL+M-CSF group; D, PDTC+sRANKL+M-CSF group; E, SIM+PDTC+sRANKL+M-CSF group. Arrows indicate osteoclasts after induction of fusion. 图 1 SIM抑制破骨细胞形成×200 Fig.1 SIM inhibited osteoclast formation ×200
图选项

2.3 TRAP染色检测破骨细胞分化

TRAP检测不同浓度的sRANKL+M-CSF对破骨细胞分化的影响, RAW264.7细胞在不同浓度的sRANKL+M-CSF诱导分化7 d, 结果按破骨细胞数(细胞核数≥3) /总细胞数来确定破骨细胞的分化效果。对照组没有破骨细胞分化, 5 ng/mL组为8%±0.15%, 15 ng/mL组为40%±1.5%, 而50 ng/mL组为15%±1.6% (P = 0.032)。其中, 浓度为15 ng/mL组的sRANKL+M-CSF具有最大的诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化的效果。因此, 将浓度为15 ng/mL的sRANKL+M-CSF诱导分化7 d作为本研究诱导分化的浓度及时间。见图 2。

A, 0 ng/mL; B, 5 ng/mL; C, 15 ng/mL; D, 50 ng/mL. 图 2 不同浓度的sRANKL+M-CSF诱导破骨细胞分化×200 Fig.2 Osteoclast differentiation induced by different concentrations of sRANKL+M-CSF ×200
图选项

2.4 SIM抑制破骨细胞的分化

RAW264.7细胞在15 ng/mL的sRANKL+M-CSF诱导分化7 d, 结果按破骨细胞数(≥3核细胞) /总细胞数确定破骨细胞的分化效果, 在诱导分化培养基中单独加入SIM (10-6 mol/L, C组破骨细胞数为18%±0.12%)及PDTC (10-5 mol/L, D组破骨细胞数为35%±0.13%, B组破骨细胞数为48%±0.25%)和SIM+PDTC (20%±0.11%)的情况下, 破骨细胞的分化受到抑制, SIM+PDTC组的一致分化效果与单独SIM组及PDTC相似(P > 0.05)。见图 3。

A, control group; B, sRANKL+M-CSF group; C, SIM+sRANKL+M-CSF group; D, PDTC+sRANKL+M-CSF group; E, SIM+PDTC+sRANKL+M-CSF group. 图 3 SIM抑制破骨细胞的分化×200 Fig.3 SIM inhibits osteoclast differentiation ×200
图选项

2.5 SIM抑制破骨细胞肌动蛋白环的形成

用荧光显微镜检测肌动蛋白环, 以观察成熟的破骨细胞肌动蛋白环的结构。sRANKL+ M-CSF能够诱导明显诱导肌动蛋白环的形成(B组:41%±0.15%), SIM能够抑制肌动蛋白环的形成(C组:10%±0.08%), 加入PDTC后的作用效果与SIM相似(D组:11%±0.13%)。见图 4。

Arrows indicate osteoclast F-actin rings. Scale bar=50 μm. 图 4 SIM抑制破骨细胞肌动蛋白环的形成 Fig.4 SIM inhibits actin ring formation in osteoclasts
图选项

2.6 SIM抑制NF-κB的核转位

免疫荧光检测结果显示, 破骨细胞分化后, p65向细胞核内转位, SIM能够抑制其向细胞核内转位。见图 5。

Arrows indicate nuclear, phosphorylated p65 protein. Scale bar=50 μm. 图 5 SIM抑制p65细胞核内转位 Fig.5 SIM inhibits intranuclear translocation of p65 in cells
图选项

2.7 Westerm blotting结果

进一步分析SIM抑制成骨细胞分化的潜在机制, 免疫印迹检测通路蛋白显示, sRANKL+M-CSF能促进细胞核内p65的磷酸化(0 min, 5 min, 30 min, 60 min), 尤以60 min时p65磷酸化明显, 加入SIM后p65的细胞核内转位受到抑制, 60 min时抑制效果明显, 提示SIM发挥其抑制破骨细胞分化的药效学机制是通过抑制NF-κB信号通路完成的(P < 0.05)。见图 6。

图 6 SIM抑制p65磷酸化 Fig.6 SIM inhibits p65 phosphorylation
图选项

3 讨论

PMOP与雌激素缺乏密切相关, 具有骨质疏松症的一般特征, 如骨小梁结构破坏和骨折风险增加[5]。研究[6-8]表明, 雌激素能抑制破骨细胞的形成。在PMOP的发病过程中, 过度激活破骨细胞形成和过度骨吸收是一个重要的因素, 因此, 抑制破骨细胞分化仍是PMOP治疗的一个重要策略。

他汀类药物具有抗血栓、抗氧化和抗炎和多效性的治疗作用。研究[9]表明, 他汀类药物对骨骼具有一定的药理学作用。还有研究[10-11]表明, 他汀类药物增加了卵巢切除的骨形成、抑制破骨细胞生成, 但其潜在机制尚不清楚。

本研究揭示了辛伐他汀抑制破骨细胞分化的潜能, TRAP染色检测显示, 辛伐他汀抑制sRANKL和M-CSF诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞的形成和分化。破骨细胞形成过程中, 细胞骨架重排导致肌动蛋白环的形成。这些肌动蛋白环在维持细胞结构中起着至关重要的作用[12]。F-肌动蛋白环检测结果表明, 辛伐他汀能够抑制破骨细胞吸收活性, 这对预防和治疗PMOP具有重要意义。

NF-κB信号通路是调节破骨细胞成熟、分化、凋亡的重要通路[13], 进一步研究辛伐他汀发挥抑制破骨细胞分化的潜在机制。结果显示, 辛伐他汀抑制NF-κB通路的核心蛋白p65的激活, 抑制p65的细胞核内转位, 进而抑制破骨细胞的分化。因此, 本研究为临床应用辛伐他汀防治PMOP提供了依据。

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