文章信息
- 王莉, 蔡旺
- WANG Li, CAI Wang
- miR-625-3p在卵巢浆液性癌中的表达及意义
- Expression and significance of miR-625-3p in ovarian serous carcinoma
- 中国医科大学学报, 2020, 49(2): 139-143
- Journal of China Medical University, 2020, 49(2): 139-143
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文章历史
- 收稿日期:2019-05-21
- 网络出版时间:2019-12-20 16:47
卵巢浆液性癌主要见于中老年人,病变形成后常伴有侵袭和转移,高级别病变患者常伴有对侧卵巢受累,并可见腹腔播散。近年研究[1]认为,浆液性癌的发生与肿瘤间质巨噬细胞的形成及其产生的炎性细胞因子有关。微小RNA(microRNA,miRNA)作为内源性非编码RNA分子,可通过调节基因表达参与肿瘤间质的炎症反应[2]。应用miRbase、Targetscans等数据库预测miR-625-3p的靶基因,可能是调节巨噬细胞形成和炎症反应的因子。本研究分析了miR-625-3p在卵巢浆液性癌中的表达,检测miR-625-3p与巨噬细胞数量及MCP-1的相关性,分析其临床价值。
1 材料与方法 1.1 一般资料收集2013年1月至2014年2月间在我院诊断为卵巢浆液性癌并行手术根治的67例患者作为观察组,患者年龄49~82(62.8±6.5)岁,中位年龄64岁。纳入患者均经病理医师复审切片,并符合世界卫生组织卵巢浆液性癌的诊断标准,患者术前未行放、化疗。排除内脏器官严重疾病及遗传性疾病、生殖系统手术史及先天发育异常的患者。收集同期我院诊断的60例卵巢浆液性囊腺瘤患者作为对照组,患者年龄43~80(61.7±6.8)岁,中位年龄62岁。均留取新鲜组织-80 ℃冻存,石蜡包埋组织。2组患者一般资料比较无统计学差异。研究经医院伦理委员会批准,患者及家属均签署知情同意书。
1.2 miR-625-3p的检测应用新鲜冻存组织,试剂盒购自美国Invitrogen公司。操作严格按说明书进行。按照试剂盒说明书提取组织中的总RNA。miR-625-3p引物:上游5’-CTCAAGTCGTAGTCGTCG-3’,下游5’-ACACTAGCTGAGTAGTAGCTT-3’;miR-155引物:上游5’-GCAACATTCTGAGTAGTCCAGACATC-3’,下游5’-CAGACCAGAGACTCCACCGGTGCTT-3’。PCR程序如下:95 ℃ 5 min,循环1次;95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,15个循环;93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 20 s,31个循环。在60 ℃时收集信号,进行实时PCR。记录Ct值,通过2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。ΔΔCt=[Ct目的基因(未知样品)-CtGAPDH(未知样品)] - [Ct目的基因(校正样品) -CtGAPDH(校正样品)]。
1.3 MCP-1和CD163的免疫组化检测应用免疫组化SP法检测石蜡包埋组织中MCP-1和CD163的表达。采用苏州睿赢公司的MCP-1和CD163试剂。以50为梯度分组进行预实验染色后,由病理医师对结果进行判读,选择MCP-1为1:50、CD163为1:100的显色最佳浓度进行实验。正式实验均由同一操作人员一次完成,DAB显色,严格按说明书进行操作,做好质控工作。结果判定:MCP-1的阳性部位是肿瘤细胞的细胞质。按二维角度进行评分。着色强度:无、弱、中、强分别计为0、1、2、3分;阳性率:随机选择2个400倍显微镜下的视野,阳性率≤5%、> 5%~10%、> 10%~30%、> 30%~50%、> 50%分别计为0、1、2、3、4分。二者相加为总分,阴性标准为≤3分,阳性标准为 > 3分。CD163的阳性部位是肿瘤间质的巨噬细胞,选择3个热点区,计数巨噬细胞的数量,取平均值。
1.4 Western blotting法检测MCP-1和CD163的表达应用术后留取的新鲜冻存组织,检测MCP-1和CD163蛋白的半定量表达。GAPDH为内参。取样本加裂解液后,离心,取上清液提取蛋白,用BCA法测定蛋白浓度;放入100 ℃水浴锅内煮5 min,配制10% SDA-PAG凝胶,加适量蛋白和Loading Buffer混合液,电泳,之后将MCP-1、CD163和GAPDH的胶段切下转移到PVDF膜上,封闭60 min,加入20 mL抗体(MCP-1和CD163均为1:1 500)和20 mL一抗稀释液,4 ℃过夜,次日洗膜,加入二抗,室温1 h后洗膜,用ECL发光液进行显影。应用ImageJ软件进行灰度分析,对蛋白与GAPDH的比值进行分析。
1.5 统计学分析采用SAS 6.12软件进行数据分析,行χ2检验、t检验、Pearson相关分析、Kaplan-Meier生存分析,以α=0.05为检验水准。
2 结果 2.1 2组miR-625-3p表达的比较观察组miR-625-3p表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1、图 1。
Item | Observation group(n = 67) | Control group(n = 60) | P |
Expression of miR-625-3p | 423.25±60.72 | 295.92±59.15 | < 0.001 |
MCP-1 positive rate [n(%)] | 37(55.2) | 12(20.0) | < 0.001 |
Number of macrophages | 132.23±24.25 | 52.32±12.23 | < 0.001 |
Semiquantitative expression of MCP-1 | 1.23±0.29 | 0.91±0.27 | < 0.001 |
Semiquantitative expression of CD163 | 1.57±0.36 | 0.98±0.26 | < 0.001 |
2.2 2组MCP-1阳性率和巨噬细胞数量的比较
观察组中MCP-1阳性率和巨噬细胞数量明显高于对照组(P < 0.05)。见表 1、图 2、图 3。
2.3 2组MCP-1和CD163半定量表达的比较
观察组中MCP-1和CD163的半定量表达明显高于对照组(P < 0.05)。见表 1、图 4。
2.4 观察组中miR-625-3p表达、MCP-1和CD163半定量表达与临床病理特征的关系
观察组中,在不同肿瘤最大径、病变级别、脉管癌栓、淋巴结转移、TNM分期中,miR-625-3p表达、MCP-1和CD163半定量表达的差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 2。
Clinicopathological feature | miR-625-3p | P | MCP-1 | P | CD163 | P |
Maximum diameter | 0.007 | 0.038 | 0.008 | |||
< 5 cm | 385.34±46.59 | 0.05±0.18 | 1.29±0.28 | |||
≥5 cm | 440.34±43.28 | 1.32±0.11 | 1.75±0.24 | |||
Lesion grade | 0.001 | 0.041 | 0.019 | |||
Low | 399.64±69.25 | 1.12±0.36 | 1.38±0.39 | |||
High | 449.37±56.97 | 1.36±0.20 | 1.77±0.34 | |||
Vascular tumor thrombus | 0.016 | 0.032 | 0.011 | |||
No | 398.37±47.24 | 1.12±0.29 | 1.41±0.39 | |||
Yes | 460.37±52.31 | 1.44±0.33 | 1.87±0.40 | |||
Lymph node metastasis | 0.042 | 0.031 | 0.024 | |||
No | 386.64±58.30 | 1.13±035 | 1.43±0.32 | |||
Yes | 470.34±64.97 | 1.41±0.20 | 1.84±0.38 | |||
TNM stage | 0.031 | 0.035 | 0.031 | |||
Ⅰ-Ⅱ | 381.62±57.46 | 1.10±0.21 | 1.40±0.45 | |||
Ⅲ-Ⅳ | 461.28±62.09 | 1.37±0.23 | 1.79±0.44 |
2.5 观察组中miR-625-3p表达、MCP-1和CD163半定量表达与增殖指数的关系
在高倍镜下(×400)根据切片大小选择10个高倍视野(包括阳性细胞最多区域),计算Ki-67染色阳性细胞占计数总细胞的百分数,取其平均值作为Ki-67的阳性率。Ki-67阳性表达主要位于细胞核中,染色呈棕黄色。见图 5。Pearson相关分析显示,观察组中miR-625-3p的表达与增殖指数呈正相关(r = 0.42,P = 0.021 5),MCP-1、CD163与增殖指数无明显相关性(P > 0.05)。
2.6 观察组中miR-625-3p、MCP-1和CD163之间的相关性
Pearson相关分析显示,观察组中miR-625-3p与MCP-1(r = 0.45,P = 0.013 2)、CD163(r = 0.46,P = 0.031 4)的表达呈正相关。
2.7 观察组中miR-625-3p表达的生存分析观察组患者随访的终点时间为2019年3月31日,失访11例。随访生存时间为11~60(35.7±11.9)个月。生存分析结果显示,miR-625-3p与生存时间有关(P < 0.05),miR-625-3p高表达则生存时间短,预后差。见图 6。
3 讨论
70%的卵巢浆液性癌患者就诊时已经是晚期,且多数已经在盆腔和腹腔内广泛转移。病变的形成与上皮细胞的异型增生有关。肿瘤分为低级别和高级别病变,均可以对周围组织形成浸润,并形成组织的破坏[3]。部分病例呈弥漫性生长,细胞间连接松散,细胞体积小,易于迁移。研究发现,肿瘤细胞和间质细胞之间的微环境对肿瘤的进展是非常重要的。间质中的浸润细胞主要包括巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞等[4]。在肿瘤中,特殊的炎症-免疫细胞(如巨噬细胞和肥大细胞)与预后不良有关,肿瘤相关的巨噬细胞分泌的MCP-1与肿瘤进展有关[5]。miR-625-3p可能有类似癌基因样的作用,能促进肿瘤的形成,使细胞停滞于幼稚阶段,具有“永生化”的DNA遗传特征[6]。研究[7-8]发现,miR-625-3p的功能是阻止细胞的分化,使细胞具有高增殖属性,异型性明显,细胞核的染色深,细胞连接不紧密。RASMUSSEN等[9]通过观察miR-625-3p在结直肠腺癌中的表达,发现其高表达与一线化疗应用奥沙利铂的敏感性有关。也有报道认为miR-625-3p是一种有价值的预测化疗敏感性的指标。p38和MAPK激活因子MAP2K6是miR-625-3p的直接靶标,通过siRNA和化学抑制剂减少p38信号,诱导对奥沙利铂的抗药性[10]。因此,其临床意义可能更广泛。
本研究结果显示,miR-625-3p在肿瘤中的表达升高,提示miR-625-3p是肿瘤形成的重要因素。观察组中miR-625-3p、MCP-1的表达与不同肿瘤最大径有关,提示二者高表达时可以促进肿瘤的生长及局部侵袭。二者与病变级别、脉管癌栓、淋巴结转移和TNM分期的关联性提示,miR-625-3p、MCP-1均是肿瘤进展的重要因素,由于以上因素均为临床判断肿瘤生物学行为的重要指标,因此二者高表达状态提示肿瘤不良的生物学行为。结果显示,卵巢浆液性癌中miR-625-3p的表达与病变的增殖指数密切相关,提示miR-625-3p表达上调后可以引起肿瘤细胞的失控性增生,细胞呈倍数扩增,细胞繁殖明显,细胞生长活跃,肿瘤生长快[11-12]。miR-625-3p对肿瘤细胞的脉管播散和促进淋巴转移有一定作用[13-14]。生存分析显示,miR-625-3p的表达可能对临床判定预后有一定价值,提示对病变组织积极检测miR-625-3p的表达,临床意义明显,即miR-625-3p高表达时患者的预后较差,反之预后较好,其临界值有待更多学者通过大样本研究确定。miR-625-3p在肿瘤细胞中高表达,在细胞形成过程表现出不同的形态,幼稚的上皮细胞成分多,相似于起源组织,细胞生长活跃[15-16]。miR-625-3p对肿瘤进展过程中的间质反应也有一定作用[17]。miR-625-3p与巨噬细胞的关系可能也是miR-625-3p对间质调节作用的一部分,继而分泌MPC-1增多,伴有肿瘤间质的炎症形成,加速肿瘤进展。
综上所述,卵巢浆液性癌中miR-625-3p高表达,对病变的形成有促进作用,miR-625-3p可能对调控细胞增殖有一定影响。miR-625-3p与MCP-1、CD163的表达均呈正相关。术后检测miR-625-3p的表达可能对判断预后有一定价值。
[1] |
张洪秀, 陈燕, 金平. 极化型肿瘤相关巨噬细胞及其与卵巢癌的相关性[J]. 国际妇产科学杂志, 2013, 40(2): 152-155. |
[2] |
RAITOHARJU E, SEPPÄLÄ I, OKSALA N, et al. Blood microRNA profile associates with the levels of serum lipids and metabolites associated with glucose metabolism and insulin resistance and pinpoints pathways underlying metabolic syndrome:the cardiovascular risk in Young Finns Study[J]. Mol Cell Endocrinol, 2014, 391(1/2): 41-49. DOI:10.1016/j.mce.2014.04.013 |
[3] |
赵丽红, 王娟, 杨晓葵. 卵巢组织中M1/M2巨噬细胞特征分子标志基因表达与组织分化程度的相关关系[J]. 临床和实验医学杂志, 2014, 13(1): 10-13. DOI:10.3969/j.issn.1671-4695.2014.01.004 |
[4] |
李彩霞, 贾玉芳, 顾光华, 等. NF-κB、MCP-1在人卵巢癌中的表达及意义[J]. 实用临床医药杂志, 2010, 14(23): 149-151. |
[5] |
杨小荣, 高国兰, 朱亚飞. M2型肿瘤相关巨噬细胞在上皮性卵巢癌中的检测[J]. 现代妇产科进展, 2011, 20(11): 851-855. |
[6] |
FANG L, XU W, KONG DD. Icariin inhibits cell proliferation, migration and invasion by down-regulation of microRNA-625-3p in thyroid cancer cells[J]. Biomedecine Pharmacother, 2019, 109: 2456-2463. DOI:10.1016/j.biopha.2018.04.012 |
[7] |
TERLECKI-ZANIEWICZ L, LÄMMERMANN I, LATREILLE J, et al. Small extracellular vesicles and their miRNA cargo are antiapoptotic members of the senescence-associated secretory phenotype[J]. Aging(Albany NY), 2018, 10(5): 1103-1132. DOI:10.18632/aging.101452 |
[8] |
WANG JR, ZHU XJ, XIONG XK, et al. Identification of potential urine proteins and microRNA biomarkers for the diagnosis of pulmonary tuberculosis patients[J]. Emerg Microbes Infect, 2018, 7(1): 63. DOI:10.1038/s41426-018-0066-5 |
[9] |
RASMUSSEN MH, LYSKJÆR I, JERSIE-CHRISTENSEN RR, et al. miR-625-3p regulates oxaliplatin resistance by targeting MAP2K6-p38 signalling in human colorectal adenocarcinoma cells[J]. Nat Commun, 2016, 7: 12436. DOI:10.1038/ncomms12436 |
[10] |
RASMUSSEN MH, JENSEN NF, TARPGAARD LS, et al. High expression of microRNA-625-3p is associated with poor response to first-line oxaliplatin based treatment of metastatic colorectal cancer[J]. Mol Oncol, 2013, 7(3): 637-646. DOI:10.1016/j.molonc.2013.02.016 |
[11] |
FANG L, KONG DD, XU W. MicroRNA-625-3p promotes the proliferation, migration and invasion of thyroid cancer cells by up-regulating astrocyte elevated gene 1[J]. Biomedecine Pharmacother, 2018, 102: 203-211. DOI:10.1016/j.biopha.2018.03.043 |
[12] |
WU XJ, ZHAO ZF, DING Y, et al. Differential expression of microRNAs in the normal skin of the Han and Uyghur populations in Xinjiang province[J]. Medicine(Baltimore), 2018, 97(7): e9928. DOI:10.1097/MD.0000000000009928 |
[13] |
郑海伦, 赵睿, 李大鹏, 等. miR-625-3p在结肠癌组织和细胞中的表达[J]. 中国病理生理杂志, 2016, 32(8): 1376-1382. DOI:10.3969/j.issn.1000-4718.2016.08.006 |
[14] |
VERMA K, JYOTSANA N, BUENTING I, et al. miR-625-3p is upregulated in CD8+ T cells during early immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation[J]. PLoS One, 2017, 12(8): e0183828. DOI:10.1371/journal.pone.0183828 |
[15] |
LYSKJÆR I, RASMUSSEN MH, ANDERSEN CL. Putting a brake on stress signaling:miR-625-3p as a biomarker for choice of therapy in colorectal cancer[J]. Epigenomics, 2016, 8(11): 1449-1452. DOI:10.2217/epi-2016-0128 |
[16] |
ZHENG HL, MA RQ, WANG QZ, et al. MiR-625-3p promotes cell migration and invasion via inhibition of SCAI in colorectal carcinoma cells[J]. Oncotarget, 2015, 6(29): 27805-27815. DOI:10.18632/oncotarget.4738 |
[17] |
KIRSCHNER MB, CHENG YY, BADRIAN B, et al. Increased circulating miR-625-3p:a potential biomarker for patients with malignant pleural mesothelioma[J]. J Thorac Oncol, 2012, 7(7): 1184-1191. DOI:10.1097/JTO.0b013e3182572e83 |