2020, Vol. 49文章信息
- 刘和合, 张欣馨, 王游津, 孔珺
- LIU Hehe, ZHANG Xinxin, WANG Youjin, KONG Jun
- 小鼠视网膜内Spata7基因敲除模型构建及其光感受器细胞凋亡机制的研究
- Mechanism of apoptosis in retinal photoreceptor cells in Spata7 knockout mice
- 中国医科大学学报, 2020, 49(12): 1070-1075
- Journal of China Medical University, 2020, 49(12): 1070-1075
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文章历史
- 收稿日期：2020-05-05
- 网络出版时间：2020-12-03 10:26
引用本文 |
视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一种进行性、不可逆性、遗传性视网膜疾病[1]。常表现为夜盲、视野缺损和渐进性视力下降。RP一般先累及中周部视网膜，逐渐向后极部进展。这是由于光感受器细胞中的视杆细胞最先发生凋亡，随着疾病进展，视锥细胞也逐渐死亡[2-3]。目前已发现超过80种基因可导致RP。Spata7基因突变是导致早发型隐性遗传RP的关键基因之一，可致光感受器细胞早期死亡[4-7]。Spata7蛋白表达于视网膜光感受器细胞中连接纤毛处，其突变导致光感受器细胞的连接纤毛破坏，引发光感受器细胞相关蛋白的内节到外节的转运障碍[8-9]。视紫红质蛋白(rhodopsin，RHO)位于光感受器细胞外节处，是维持光感受器细胞功能的重要蛋白。当RHO合成后无法被转运到光感受器细胞外节时，会停留在光感受器细胞内质网(endoplasmic reticulum，ER)，导致ER应激，并发生光感受器细胞死亡[10-13]。部分RP是由于RHO在光感受器细胞ER内的非正常折叠或运输障碍造成。由此推测Spata7基因突变可能导致RHO在ER内聚集，发生ER应激，导致光感受器细胞死亡。
规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR) /Cas9技术是近年来用于基因敲除的基因编辑方法，多用于全身目的基因敲除[14-16]。本研究首次运用腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)作为载体，将CRISPR/Cas9系统搭载入视网膜，构建Spata7视网膜内敲除模型，验证了CRISPR/Cas9技术视网膜内靶向敲除的有效性，并进一步探讨了Spata7基因在光感受器细胞中的功能。
1 材料与方法 1.1 实验动物C57BL/6基因背景的野生型小鼠在12 h光照和12 h暗适应下饲养。本研究严格遵守ARVO关于在眼科和视觉研究中的动物使用声明，实验方案获得中国医科大学伦理委员会的批准。
1.2 方法 1.2.1 AAV载体的构建运用http://crispr-era.stanford.edu网站进行Spata7 gRNA的设计，选取分数最高的gRNA (GTTCTGGACTTCGCTGGAGG)。将Spata7 gRNA克隆进pTR-GRK1 AAV8载体，同时将GFP克隆入同一载体，形成AAV8-GRK1-GFP-Spata7 gRNA结构。将Cas9单独克隆入另一载体，形成AAV8-GRK-Cas9载体结构。AAV8-Spata7gRNA和AAV8-Cas9的病毒浓度分别为3.15×1013和3.45×1013 vg/mL。
1.2.2 视网膜下注射AAV8-Spata7gRNA-GFP与AAV8-Cas9按1︰1混合。将出生14 d的小鼠分为2组，实验组右眼注射1 µL AAV混合液，左眼注射等量PBS，对照组左右眼均注射1 µL PBS，以对照注射本身对左右眼带来的损伤。将小鼠麻醉后，用30号斜角针头在角巩膜缘睫状体平坦部进行浅穿刺，将35号钝针引入玻璃体腔并向腹侧推进，直到针尖穿过视网膜，用超微量泵Ⅱ和Micro4控制器将病毒悬液注入视网膜下间隙。
1.2.3 视网膜电生理检查将小鼠置于暗室过夜后，在暗室内行暗适应视网膜电图(electroretinogram，ERG)检查，采用6个闪光强度(-34，-24，-14，-4，0，10 dB)记录a波和b波。
1.2.4 实时PCR于注射1个月后摘取小鼠视网膜，三唑试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA，DNA酶Ⅰ (美国Invitrogen公司)处理，防止基因组DNA污染。反转录产生cDNA。采用Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (美国Fisher Scientific公司)和StepOne实时PCR系统(美国Invitrogen公司)测定敲除后Spata7的mRNA表达水平，并用GAPDH进行标准化。Spata7上游引物序列为5’- TACCCGCCCATAAAGTCAAG-3’，下游引物序列为5’-CAGATGGGGACAGTGATGTG-3’；GAPDH引物序列为5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，5’-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3’。
1.2.5 免疫荧光检测及HE染色处死小鼠后，取眼球置入Davidson’s fixative溶液固定过夜，脱水、包埋、切片，制成7 µm厚切片。切片脱蜡后行抗原修复，冷却后用1×PBS清洗。于0.5%TBS-Triton X中孵育20 min后，在含有10%山羊血清的缓冲液中室温孵育1 h，加入1︰500鸡抗GFP、1︰25小鼠抗cas9、1︰500小鼠抗RHO抗体和1︰100兔抗chop，4 ℃孵育过夜。TBS洗涤，二抗(1︰500 Alexa Fluor®488结合山羊抗兔IgG、1︰500 Cy3®山羊抗鼠IgG、1︰500 Cy3®山羊抗鸡IgG)室温下孵育2 h。用1︰1 000 Topro3/DAPI和洗涤液对细胞核进行复染。最后，在载玻片上滴入长效防污剂(美国Life Technologies公司)。石蜡切片HE染色，所有切片取材位置相同，为靠近视盘中央处。
1.3 统计学分析采用GraphPad Prism5统计软件进行数据分析和图表绘制，采用独立样本t检验比较，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 Spata7体内敲除后眼底照相对AAV注射1个月后的实验组小鼠进行眼底照相，观察小鼠的视网膜损伤情况以及GFP的表达情况。如图 1所示，在正常光频道下，可见AAV注射眼视网膜鼻上方及颞上方血管弓附近视网膜色素上皮萎缩、边界不清，视网膜鼻上方可见星状白色增殖膜，病灶面积约占视网膜10%~20%，病灶内继发色素增殖呈斑驳样，并伴有部分黄色渗出，视盘周围血管纹理清晰，色泽正常。病灶周边可见荧光着染，提示GFP在AAV注射眼视网膜细胞内大量表达。蓝光下可见与PBS注射眼相比，AAV注射眼有大量的GFP表达，几乎覆盖整个视网膜，表达效率约为80%。说明病毒注射成功，视网膜注射和病毒感染保持较高效率。
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| 图 1 视网膜下腔注射1个月后实验组小鼠眼底照相检查结果 Fig.1 Fundus imaging results of mice in experimental group one month after injection |
根据小鼠视网膜眼底照相结果确定病毒感染成功后，取实验组及对照组小鼠各4只行ERG，检查注射后光感受器细胞的功能。结果如图 2所示，在不同光照强度下，对照组小鼠左右眼a波和b波数值接近(P > 0.05)，且在正常数值范围内(在光强度为1 cd2/m2时，a波正常值为100~150 μv，b波正常值300~350 μv)。说明视网膜下腔注射不会对视网膜造成损伤。而实验组小鼠在不同光照强度下，AAV注射眼a波和b波均明显低于PBS对照眼，在光强度为1 cd2/m2时，a波降低约100 μv，b波降低约200 μv (P < 0.05)，提示AAV注射眼光感受器细胞大量死亡。
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| A, a wave and b wave amplitude in control group; B, a wave and b wave amplitude in experimental group. 图 2 视网膜下注射1个月后2组小鼠ERG检查结果 Fig.2 One month after sub-retinal injection, the results of ERG in the two groups were examined |
2.2 Spata7基因体内敲除的效率
将4只注射AAV 1个月后的实验组小鼠处死，取视网膜行实时荧光定量PCR检测。结果显示，AAV注射眼Spata7的表达效率比PBS注射眼低54%，差异有统计学意义(P < 0.05)。说明1 µL AAV病毒/CRISPR系统混合液(浓度3×1013 vg/mL)行一次性视网膜下腔注射对Spata7基因的敲除效率为54%。
2.3 HE染色结果HE染色结果如图 3所示，对照组(左右眼均注射PBS)左右眼视网膜光感受器细胞层厚度一致且未见明显细胞死亡。进一步说明了视网膜下腔注射不会对光感受器细胞产生大的损伤，且左右眼注射水平相对一致。而实验组小鼠AAV注射眼光感受器细胞层(外核层)明显薄于PBS对照眼，意味着Spata7部分敲除后光感受器细胞大量死亡。
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| A, PBS treated eyes in control group; B, AAV treated eye and PBS treated eye in experimental group. Scale bar=20 μm. ONL, outer nuclear layer; INL, inner nuclear layer. 图 3 实验组和对照组小鼠的HE染色结果 Fig.3 HE Staining results of the mice in experimental and control groups |
2.4 免疫荧光染色结果
免疫荧光染色结果显示，GFP和Cas9蛋白的表达基本覆盖整个视网膜，与眼底照相结果一致。AAV-Spata7-GFP-gRNA和AAV-Cas9病毒可感染同一光感受器细胞，实现了对细胞内Spata7基因的敲除(图 4)。与PBS注射眼相比，实验组小鼠AAV注射眼ER内RHO大量表达于光感受器细胞内节，少量表达于外核层。同时，在AAV注射眼光感受器细胞内节中可见ER应激标记蛋白CHOP的表达(图 5)。
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| A, GFP and Cas9 immunofluorescence staining results in the whole retina (scale bar =50 μm); B, GFP and Cas9 immunofluorescence staining results in ONL (scale bar =20 μm). OS, outer segment; IS, inner segment. 图 4 GFP与Cas9蛋白的免疫荧光染色结果 Fig.4 Immunofluorescence staining results of GFP and Cas9 |
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| A, AAV treated eye and PBS treated control eye (scale bar =50 μm); B, AAV treated eye and PBS treated control eye (scale bar =20 μm). 图 5 RHO和CHOP免疫荧光染色结果 Fig.5 Immunofluorescence staining results of RHO and CHOP |
3 讨论
为了研究Spata7基因突变后光感受器细胞死亡的机制，本研究首次运用AAV载体和视网膜下腔注射技术，在小鼠视网膜内建立了CRISPR/Cas9系统，对Spata7基因进行视网膜内特异性敲除。实验组小鼠眼底照相显示GFP高表达，免疫荧光显示GFP和Cas9蛋白广泛表达，qRT-PCR显示Spata7 mRNA表达水平显著降低，均表明AAV感染及Spata7视网膜内敲除效率较高；实验组小鼠ERG a波和b波峰值显著降低，视网膜光感受器细胞层(外核层)明显变薄，表明光感受器细胞大量死亡，提示Spata7基因视网膜内敲除模型建立成功。该模型的建立，对比传统意义上利用CRISPR/Cas9技术构建Spata7基因敲除鼠，获得的效果等同，即敲除后早期即发生光感受器细胞大量死亡。但本模型的优势在于定点敲除视网膜内的Spata7基因，而全身其他器官的Spata7基因则被保留，因此，不影响小鼠发育及其他器官功能，尤其是公鼠的睾丸功能，保证了敲除鼠的生育能力。同时，该方法与利用Cre-Loxp系统构建的选择性敲除鼠相比，优势在于耗时少，方法简单，不需要进行筛选[17-18]，既避免了全身敲除对小鼠其他器官功能带来伤害，又大幅节省了研究时间，提高了研究效率。同为运用AAV作为载体搭载CRISPR/Cas9系统进入视网膜，另一研究团队用此方法对小鼠RHO基因进行了敲除，但其AAV对视网膜的感染效率仅为30%，目的基因的敲除效率也随之显著降低[19]。而本研究通过改进小鼠视网膜下腔注射的进针角度，大幅提高了AAV感染效率。小鼠视网膜下腔注射常规进针角度与水平面成45°，但本研究组发现由于出生14 d小鼠与成年鼠眼位有细微差别，导致斜行45°进针并不能保证注射位点靠近视网膜后极部，从而导致AAV感染效率降低，故将进针角度调高至75°~80°，保证了注射位点靠近后极部，大幅度提高了AAV对视网膜的感染效率(80%)，保证了CRISPR/Cas9系统对Spata7基因的有效敲除。
本研究对Spata7基因视网膜内敲除1个月后光感受器细胞的死亡机制进行了探讨。结果显示，RHO在实验组小鼠AAV注射眼光感受器细胞内节中呈高表达，提示RHO滞留在光感受器细胞ER内。ER应激标记蛋白CHOP在小鼠AAV注射眼光感受器细胞内节中高表达，意味着RHO在ER内的聚集引发了ER应激。说明视网膜内敲除Spata7基因后，RHO不能被转运到光感受器细胞外节，而停留在了ER，造成了ER应激，导致光感受器细胞凋亡。
本研究也存在局限性:仅探讨了AAV注射1个月后Spata7基因的敲除情况及敲除后的光感受器细胞死亡情况，关于AAV搭载的CRISPR/Cas9系统对Spata7基因的远期敲除效应还有待继续研究；仅对AAV注射眼和PBS对照眼的光感受器细胞死亡情况和RHO运输情况进行了比较，未对AAV注射眼内不同AAV注射效率区域之间进行比较；Spata7视网膜内的敲除效率还可进一步提高。对此，可将常用的、分子量较大的SpCas9改为近年新发现的、分子量较小的SaCas9，使Cas9、gRNA和GFP包装进入同一AAV载体，以克服AAV载体容量有限不能同时搭载这三者的局限性[20]，同时在此基础上可设计多个gRNA同步定位Spata7基因，以提高敲除效率。
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