宫颈癌是威胁女性生命健康的妇科肿瘤疾病。在中国，每年有13.15万宫颈癌新发患者，占全球新发宫颈癌的28.8%^[1]。高危型人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染已确定与宫颈癌的发病密切相关，在宫颈癌中，HPV是位于皮肤表层的感染侵袭，因此奠定了T细胞介导的细胞免疫在宫颈癌免疫应答中的地位^[2]。T细胞免疫球蛋白黏蛋白（T cell immunoglobulin mucin domain containing molecules，TIM）-3是TIM家族中的一员。目前研究^[3]表明，其在自身免疫性疾病、慢性病毒感染及肿瘤的发生发展中均发挥着重要的调控作用。TIM-3可与多种配体结合，进而抑制T细胞介导的免疫应答，参与诱导免疫耐受^[4]。TIM-3已经被证实在非小细胞肺癌^[5]、胃癌^[6]、食管癌^[7]和前列腺癌^[8]等多种癌症外周血T细胞中高表达，但有关TIM-3在宫颈癌外周血T细胞中的表达鲜有研究。因此，本研究主要检测了宫颈癌患者外周血中CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表达水平及T细胞中TIM-3的表达情况，并探讨TIM-3的表达与宫颈癌患者病理参数的相关性，为TIM-3成为宫颈癌患者临床免疫治疗提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 临床资料

研究标本来自2017年8月至2018年1月于中国医科大学附属盛京医院妇科病房住院手术的患者。观察组包括宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅱ~Ⅲ期15例，年龄范围为23~55岁；宫颈癌患者24例，年龄范围为30~63岁。对照组为术后石蜡病理证实为畸胎瘤且宫颈筛查未见异常（宫颈HPV检测为阴性且液基细胞学检查未见上皮内病变）的患者，共21例，年龄范围为20~42岁。2组患者年龄等一般资料无统计学差异（P > 0.05）。根据国际妇产科协会（Federation International of Gynecology and Obstetr，FIGO）临床分期（2009年）将宫颈癌患者分为Ⅰ~Ⅱ期16例，Ⅲ~Ⅳ期8例，所有患者均签署知情告知同意书，研究获得中国医科大学盛京医院伦理委员会批准。纳入标准：（1）所有患者均非亲属关系；（2）所有病例组患者均经病理学证实，CIN患者均经术后病理证实，宫颈癌患者为原发性宫颈癌，不伴有其他肿瘤疾病；（3）所有患者均为未进行放疗或者化疗的初诊患者。排除标准：（1）1个月内接受过输血治疗的患者；（2）合并免疫系统疾病或使用过免疫相关药物的患者；（3）2周内进行过抗炎治疗的患者。

1.2 仪器与试剂

人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限公司）；Multifuge 3SR+台式冷冻离心机（德国赫利氏公司）；流式细胞仪（美国BD公司的BD FACSCalibur型流式细胞仪）；FITC标记的鼠抗人CD4单克隆抗体（货号：555346，美国BD公司）；PE-Cy5标记的鼠抗人CD8单克隆抗体（货号：555636，美国BD公司）；PE标记的鼠抗人TIM-3单克隆抗体（货号：fab2365p，美国RD公司）。

1.3 方法

取所有受试者清晨空腹静脉外周血2 mL，使用肝素钠抗凝管常温保存。用密度梯度离心法提取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），将PBMC悬液中加入5倍体积PBS混匀，水平2 000 r/min离心5 min，4 ℃。弃上清，PBS重悬后加入PE-Cy5标记的鼠抗人CD4单克隆抗体、FITC标记的鼠抗人CD8单克隆抗体、PE标记的鼠抗人TIM-3抗体进行标记，避光孵育30 min；采用PBS清洗2次，1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入PBS重悬。采用流式细胞术检测CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞及细胞表面TIM-3的表达。

1.4 统计学分析

所有标本经过Flowjo7.6.5分析，数据录入SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，并使用GraphPad Prism 6软件绘制图形。计量数据以x±s表示，采用LSD-t检验进行多个样本均数两两之间的比较，计数资料统计采用Fisher确切法，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 宫颈癌患者外周血T细胞的表达

荧光标记宫颈病变患者及非宫颈病变患者外周血CD4⁺T细胞及CD8⁺T细胞，流式细胞仪分析后数据再进行统计学分析。结果表明，在宫颈病变患者中，宫颈癌（18.54%±7.52%）及CIN患者（21.29%±11.31%）外周血中的CD4⁺T细胞百分比明显低于非宫颈病变患者（30.43%±8.43%），差异有统计学意义（P < 0.05），但是宫颈癌与CIN变患者之间无统计学差异。CIN外周血中的CD8⁺T细胞百分比（20.38%±9.79%）较非宫颈病变患者（27.35%±11.67%）明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。宫颈癌患者外周血中的CD8⁺T细胞百分比（16.17%±9.27%）也较非宫颈病变患者（27.35%±11.67%）明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。而宫颈癌患者与CIN患者外周血中的CD8⁺T细胞百分比无统计学差异。

2.2 TIM-3在宫颈癌患者外周血T细胞表面的表达

流式细胞仪方法分析TIM-3在外周血CD4⁺T及CD8⁺T细胞的表达（图 1、2），结果显示，TIM-3在CIN患者及宫颈癌患者外周血CD4⁺T细胞表面的表达量分别为8.24%±9.58%及8.38%±9.13%，高于对照组的表达量（3.41%±2.82%），差异有统计学意义（P < 0.05）。TIM-3在CIN患者及宫颈癌患者外周血CD8⁺T细胞表面的表达量分别17.72%±10.55%及18.78%± 10.22%，较对照组的表达量（11.11%±5.49%）高，差异有统计学意义（P < 0.05）。而宫颈癌患者与CIN患者外周血CD8⁺T细胞表面的表达量无统计学差异。

2.3 TIM-3在宫颈癌患者外周血T细胞表达与临床病理因素的关系（表 1）

对24位宫颈癌患者进一步分析，结果显示，Ⅲ~Ⅳ期患者外周血中的TIM-3在CD4⁺T及CD8⁺T细胞中的百分比与I~Ⅱ期比较有统计学差异，TIM-3在宫颈癌外周血T细胞表面的表达水平与FIG0（2009年）临床分期相关（P < 0.05），与淋巴结转移、肿物大小、年龄及鳞状细胞癌抗原值高低无相关性（P > 0.05）。

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，在病毒感染初期CD4⁺T（Th0）细胞在接受到不同信号的刺激后，分别向适应机体条件的方向分化，肿瘤微环境中T细胞的功能障碍或衰竭是肿瘤发病的关键机制^[9-10]。目前，恢复功能障碍T细胞的抗肿瘤活性已成为肿瘤免疫治疗领域的研究热点^[11-12]。

TIM-3是TIM家族中的一员，于2002年首次于小鼠Th1及CD8⁺T细胞上被发现^[4]，随后的研究^[13-16]表明TIM-3也表达于树突细胞（dendritic cell，DC）、自然杀伤（natural killer，NK）细胞及肥大细胞等固有免疫细胞表面。TIM-3在慢性病毒感染和肿瘤中起负性免疫调节作用，其持续表达能诱导T细胞的凋亡，导致T细胞功能耗竭^[17-19]。JONES等^[20]研究表明，TIM-3在获得性免疫缺陷综合征患者的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面高表达，与CD4⁺T细胞数量成反比，与血浆中病毒载量呈正相关。在慢性乙型病毒感染性肝炎患者中，TIM-3在乙型肝炎病毒特异性CD8⁺T细胞表面的表达水平明显升高，通过阻断Gal-9/TIM-3信号通路可以有效恢复乙型肝炎病毒特异性CD8⁺T细胞的功能^[21-22]。但TIM-3在宫颈癌领域少有研究，本研究结果显示，宫颈病变（宫颈癌及CIN）患者较非宫颈病变患者外周血CD4⁺T细胞及CD8⁺T细胞减少，但外周血CD4⁺T细胞及CD8⁺T细胞表面的TIM-3表达水平明显升高，与TIM-3在其他疾病中的研究结果一致。本课题组的前期研究^[23]显示，Galetin-9在宫颈鳞状癌中过度表达，并且与FIGO（2009年）分期呈正性作用，以上结果均与本研究的结果契合。TIM-3作为免疫负性调节家族中一员，其高表达可诱导T细胞凋亡，导致T细胞功能耗竭，使宫颈病变患者CD4⁺T细胞及CD8⁺T细胞的表达百分比减少，从而促进宫颈癌的发生发展。

本研究进一步深入分析了宫颈癌的不同临床病理因素与TIM-3在外周血T细胞表达水平的关系。结果显示，TIM-3在外周血T细胞的表达水平与宫颈癌的分期呈正相关。与年龄、肿瘤大小、淋巴结转移及鳞状细胞癌抗原升高无相关性。说明宫颈癌的发生的发展可能是一个多因素多环节的过程。

本研究结果显示，TIM-3在宫颈癌外周血T细胞表面高表达，并且与分期呈正性关系，对宫颈癌的早期病毒感染期的预防治疗提供依据，同时为疾病的靶向特异性治疗提供理论依据。然而本研究对于TIM-3在宫颈癌中具体的作用机制并未进行深入研究，并且缺乏组织水平上研究，日后仍然需要大量实验进一步研究。TIM-3很可能成为一种新的免疫学治疗靶点。