喉癌是发生在喉部的恶性肿瘤，以鳞状细胞癌多见，是耳鼻喉科最常见的恶性肿瘤之一^[1]。在我国，喉癌约占全身恶性肿瘤的2.1%，占头颈部肿瘤的13.9%，且发病率仍呈上升趋势^[2-4]。喉癌患者以40~60岁为主，在我国东北和华北地区发病率高，且男性发病率高于女性^[2-4]。喉癌的发病与吸烟、饮酒、性激素水平、人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染、职业因素、空气污染等因素有关，其中吸烟和饮酒是主要危险因素^[5]。目前，喉癌相关研究虽有很大进展，但其发生发展的分子机制仍不清楚。因此，从分子水平研究喉癌发生发展机制显得尤为重要，为喉癌分子诊治的深入研究提供线索。

MYCT1是本课题组前期发现的与喉癌相关的基因^[6]。在喉癌中MYCT1是潜在的抑癌基因，能够抑制喉癌细胞增殖和迁移能力，促进细胞凋亡^[7-8]。PRSS21基因编码膜蛋白睾丸素，特异性表达于睾丸^[9]。研究^[10]发现，PRSS21在肿瘤中参与多种生物学功能的调控。前期本课题组通过iTRAQ技术在稳转MYCT1的喉癌细胞中检测到PRSS21蛋白表达降低，提示PRSS21与喉癌的发生发展相关。本研究拟在喉癌细胞中初步探讨MYCT1对PRSS21表达的影响及其通过PRSS21对喉癌细胞增殖和迁移能力的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

人喉癌细胞系Hep-2细胞、人口腔角质细胞系HOK细胞购自中国科学院上海生命科学院；喉癌样本来自解放军北部战区空军医院耳鼻喉科；MYCT1过表达载体、空质粒载体购自中国基凯公司；si-MYCT1、si-PRSS21和NC购自中国生工公司；胎牛血清、RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；RNAiso Plus、Primescript RT reagent Kit购自日本TaKaRa公司；jetPRIME transfection reagent购自法国Polyplus公司；SYBR qPCR Master Mix购自美国Vazyme公司；细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自中国碧云天公司；BCA蛋白含量检测试剂盒购自中国凯基生物公司；anti-MYCT1 antibody ab107968购自英国abcam公司；alpha Tubulin Mouse Monoclonal antibody、ATP/A/ Rabbit PolyAb购自美国Proteintech公司；PRSS21 antibody购自中国absin公司；Cell Counting Kit-8购自美国bimake公司；1%结晶紫染色液购自中国Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人喉癌细胞系Hep-2细胞接种于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基中，人口腔角质细胞系HOK细胞接种于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中，两者均在5%CO₂、37 ℃及饱和湿度的条件下常规培养，待细胞生长至对数生长期时用于实验。

1.2.2 细胞转染

转染前1 d，将对数生长期的Hep-2细胞以3×10⁵/孔接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基进行培养，当细胞密度达到60%~70%时进行转染。将MYCT1过表达载体、空质粒载体、si-MYCT1、si-PRSS21和NC等分别加入jetPRIME Buffer中，再加入jetPRIME Transfection Reagen配制转染混合液，涡旋10 s室温孵育10 min。将孵育好的混合液加入6孔板中，混匀，培养6 h后更换RPMI 1640完全培养基继续培养，48 h后收取细胞用于实时PCR检测，72 h后收取细胞用于Western blotting检测。

过表达MYCT1实验分组为空载体对照组和MYCT1组；干扰MYCT1实验分组为NC对照组和si-MYCT1组；细胞功能实验分组为NC对照组、si-PRSS21组、si-MYCT1组和si-MYCT1 +si-PRSS21共转染组。

1.2.3 实时PCR检测

取细胞、喉癌组织和癌旁组织，提取总RNA并检测RNA纯度和浓度。使用反转试剂盒配置反转体系将RNA反转为cDNA，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ +∞。以cDNA为模板按照SYBR qPCR Master Mix配置扩增体系，进行实时PCR，反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共40个循环，溶解曲线分析：65~95 ℃。结果用2^-ΔΔct法计算并用相对定量表示。实时PCR引物序列见表 1，GAPDH为内参基因。

1.2.4 Western blotting检测

取细胞、喉癌组织和癌旁组织，用细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒提取浆蛋白和膜蛋白。测定蛋白浓度后，在蛋白中加入上样缓冲液，100 ℃煮10 min使蛋白变性。配制10%分离胶和5%浓缩胶，取20 μg蛋白样品进行SDS-PAGE琼脂糖凝胶电泳。在4 ℃、200 mA恒流条件下转膜1 h。用5%脱脂牛奶室温封闭2 h。一抗4 ℃孵育过夜、二抗37 ℃孵育1 h后，用超敏ECL化学发光试剂盒发光显影，对结果进行灰度分析。

1.2.5 CCK-8检测细胞增殖实验

细胞转染6 h后，用胰酶消化细胞重悬成浓度为5×10⁴/mL的细胞悬液，将其接种于96孔板中，每孔100 μL，每组设置5个复孔。常规培养一定时间(24 h、48 h和72 h)后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h，用酶标仪测定450 nm处的光密度，并绘制曲线图。

1.2.6 克隆形成实验

细胞转染6 h后，用胰酶消化细胞重悬成细胞悬液，将其接种于6孔板中，3×10³/孔，并添加2 mL完全培养基。将6孔板放入培养箱中继续培养。当细胞团中细胞个数达到50时停止培养，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，自来水侧面冲洗干净，拍照计数。

1.2.7 划痕实验

待转染细胞长满后，用200 μL无菌移液枪枪头在6孔板中画直线，用磷酸缓冲液洗去划落的细胞，并拍照记录。加入无血清和抗生素的培养基继续培养24 h后，再次拍照记录，计算细胞迁移距离。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据均以x±s表示。2组间的比较采用t检验，多组间的比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义，实验均重复3次以上。

2 结果 2.1 PRSS21在喉癌中高表达

采用实时PCR和Western blotting检测44例喉癌样本和细胞中PRSS21的表达情况。实时PCR结果显示，喉癌组织中PRSS21的表达水平显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P = 0.026 6)，见图 1A；喉癌细胞Hep-2细胞中PRSS21的表达水平显著高于口腔角质细胞HOK细胞，差异有统计学意义(P = 0.008 0)，见图 1B。Western blotting结果显示，PRSS21在口腔角质细胞HOK细胞中不表达，在喉癌细胞Hep-2细胞中高表达，差异有统计学意义(P = 0.037 4)，见图 1C。

2.2 MYCT1抑制PRSS21在喉癌细胞中的表达

采用实时PCR和Western blotting检测转染细胞中MYCT1和PRSS21表达水平变化。结果显示，与对照组空载体相比，MYCT1组Hep-2细胞中MYCT1表达明显升高(P = 0.005 4和P = 0.010 4)，但PRSS21表达降低(P = 0.031 5和P = 0.046 8)，差异有统计学意义，见图 2A、B。与对照组NC相比，si-MYCT1组Hep-2细胞中MYCT1表达明显降低(P = 0.034 7和P = 0.037 5)，但PRSS21表达升高(P = 0.044 9和P = 0.024 2)，差异有统计学意义，见图 2C、D。

2.3 MYCT1通过PRSS21抑制喉癌细胞的增殖能力

CCK-8实验结果显示，与对照组NC比，si-MYCT1组Hep-2细胞在培养24 h、48 h和72 h后增殖能力显著增强，差异有统计学意义(P = 0.046 2，P = 0.027 4和P = 0.019 6)；si-PRSS21组Hep-2细胞在培养24 h、48 h和72 h后增殖能力显著减弱，差异有统计学意义(P = 0.034 2，P = 0.021 9和P = 0.036 2)，见图 3A。si-PRSS21 +si-MYCT1组回复实验结果表明，PRSS21逆转了MYCT1对喉癌细胞增殖能力的影响，差异有统计学意义(P = 0.035 2，P = 0.048 6和P = 0.020 5)，见图 3A。

克隆形成实验结果显示，与对照组NC比，si-MYCT1组Hep-2细胞克隆形成数目显著增加，差异有统计学意义(P = 0.025 1)；si-PRSS21组Hep-2细胞克隆形成数目显著减少，差异有统计学意义(P = 0.038 6)，见图 3B。si-PRSS21 +si-MYCT1组回复实验结果表明，PRSS21逆转了MYCT1对喉癌细胞克隆形成的影响，差异有统计学意义(P = 0.018 5)，见图 3B。上述结果表明，MYCT1可通过PRSS21显著抑制喉癌细胞的增殖能力。

2.4 MYCT1通过PRSS21抑制喉癌细胞的迁移能力

划痕实验结果显示，与对照组NC比，si-MYCT1组Hep-2细胞在培养24 h后迁移能力显著增强，差异有统计学意义(P = 0.014 2)；si-PRSS21组Hep-2细胞在培养24 h后迁移能力显著减弱，差异有统计学意义(P = 0.042 7)，见图 4。si-PRSS21 +si-MYCT1组回复实验结果表明，PRSS21逆转了MYCT1对喉癌细胞迁移能力的影响，差异有统计学意义(P = 0.027 7)，见图 4。上述结果表明，MYCT1可通过PRSS21显著抑制喉癌细胞迁移能力。

3 讨论

近年来，我国喉癌的发病率不断上升^[2-4]。喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，研究影响喉癌生物学功能的基因对喉癌的诊断和治疗具有重要意义。

研究^[9]表明，PRSS21具有组织特异性，发挥促进或抑制肿瘤发生发展的作用。PRSS21正常表达于减数分裂前睾丸生殖细胞，在睾丸生殖细胞肿瘤中不表达，PRSS21是睾丸肿瘤发生的抑制因子^[11-12]。PRSS21在其他正常组织中表达水平很低或不表达，在卵巢癌、宫颈癌、胃癌等多种不同来源的肿瘤中高表达，发挥促癌作用^{[9, 13-16]}。TANG等^[10]证明PRSS21促进上皮细胞恶性转变，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞生长，诱导体内肿瘤形成。DRIESBAUGH等^[16]发现，PRSS21激活蛋白酶激活受体PAR-2，影响下游信号通路，抑制卵巢肿瘤细胞的凋亡。YEOM等^[15]首次证明，在宫颈癌中PRSS21阻断maspin介导的细胞死亡途径，增加细胞的侵袭和迁移，从而促进了肿瘤的发生。然而PRSS21与喉癌的关系尚未见报道。

本研究利用实时PCR和Western blotting检测PRSS21在正常和喉癌细胞及组织中的表达水平，结果发现PRSS21在正常细胞或组织中不表达或低表达，在喉癌细胞或组织中显著高表达。随后利用CCK-8、克隆形成和划痕实验检测PRSS21对喉癌细胞生物功能的影响，结果显示，PRSS21能显著促进喉癌细胞的增殖和迁移。由此推测PRSS21在喉癌中发挥促癌作用。研究^[8-9]发现，MYCT1在喉癌中发挥抑癌作用。进一步结果表明，MYCT1抑制喉癌细胞中PRSS21的表达，继而抑制喉癌细胞的增殖和迁移能力。

在正常细胞中，启动子甲基化是调控基因表达的重要机制。而在肿瘤细胞中，异常启动子甲基化或去甲基化可导致基因异常表达。PRSS21基因启动子区包含5个CpG岛和5个CpG富集区域，容易被甲基化^[9]。KAWANO等^[11]首次证实在睾丸生殖细胞肿瘤中PRSS21因启动子高甲基化表达沉默。随后KEMPKENSTEFFEN等^[12]发现了PRSS21基因沉默涉及的异常甲基化CpG位点。本课题组通过iTRAQ技术在稳转MYCT1的喉癌细胞中检测到METTL7A蛋白表达增加和MBD4蛋白质表达减少(数据未出示)。METTL7A是一种甲基转移酶，促进基因启动子甲基化；MBD4是与甲基- CpG结合域(MBD)有关的核蛋白家族的成员，能够特异性结合甲基化DNA，抑制基因启动子甲基化。由此推测MYCT1可能通过促进PRSS21启动子甲基化从而抑制其表达，进而影响喉癌细胞生物学功能，但有待进一步研究证实。

综上所述，本研究首次证明了MYCT1通过抑制PRSS21的表达抑制喉癌细胞的增殖和迁移能力。该研究结果有助于为MYCY1通过PRSS21参与喉癌发生发展分子机制的深入研究奠定理论基础。