2019, Vol. 48文章信息
- 陆晓云, 张斌, 佟芳
- LU Xiaoyun, ZHANG Bin, TONG Fang
- miR-142-3p表达对卵巢癌SKOV3细胞生长和转移的影响
- Effect of miR-142-3p Expression on Growth and Metastasis of SKOV3 Ovarian Cancer Cells
- 中国医科大学学报, 2019, 48(9): 817-821
- Journal of China Medical University, 2019, 48(9): 817-821
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文章历史
- 收稿日期：2019-02-22
- 网络出版时间：2019-09-09 9:19
引用本文 |
2. 大连医科大学附属第一医院 肿瘤科, 辽宁 大连 116011
2. Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, China
卵巢癌是女性常见的具有较高恶性程度的肿瘤，5年生存率仅为25%~35%[1]。卵巢癌的发病机制复杂，复发率高，虽然目前卵巢癌治疗取得了明显的进展，但其长期预后差。因此了解卵巢癌的发病机制可以为临床治疗提供理论基础。高迁移率族蛋白A2（high mobility group protein A2，HMGA2）是一类结构转录因子，在很多肿瘤中过表达，在卵巢癌组织中也过表达，可能与肿瘤的转移有关[2]。HMGA2可以通过蛋白质-DNA或者蛋白质-蛋白质相互作用调节多个基因来发挥作用。HMGA2作为肿瘤蛋白在很多癌症（乳腺癌、食管鳞状癌、结直肠癌和卵巢癌等）中表达上调[3-6]，但HMGA2在卵巢癌中的调控机制仍不清楚。
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约22个核苷酸小分子的非编码RNA，它通过与靶基因mRNA的3’非翻译区结合而抑制靶基因转录，进而终止基因翻译[7]。有研究[8]报道miRNA在很多种类肿瘤中表达异常，发挥着致癌或抑制癌症的作用。研究[9]发现miR-142-3p在结直肠癌中表达降低。本研究拟分析miR-142-3p在卵巢癌组织中的表达，并探讨miR-142-3p对卵巢癌SKOV3细胞生长和转移的影响。
1 材料与方法 1.1 卵巢癌标本与试剂收集2017年8月至2018年7月大连医科大学附属第一医院妇产科40例卵巢癌女性患者的卵巢癌组织标本，患者年龄30~75岁，平均年龄61.5岁。其中20例患者取癌旁正常组织（癌边缘2.5~3.5 cm）放入准备好的冻存管，保存于液氮里。临床病例资料完整，病理诊断和分期，组织分化程度等均有相关证据。试剂包括人卵巢癌细胞株SKOV3（中国医学科学院细胞中心）、DMEM培养基（美国Hyclone公司）、Trizol与转染所用脂质体（美国invitrogen公司）、miR-142-3p引物与U6引物（大连宝生物工程有限公司合成）、miR-142-3p和HMGA2模拟物及对照序列（大连宝生物工程有限公司合成）。
1.2 细胞培养与转染SKOV3细胞使用DMEM培养基（含10%新生胎牛血清），在5%CO2、37 ℃、95%湿度下培养。将miRNA-空白对照（miR-NC）或miR-142-3p、HMGA2模拟物转染至人卵巢癌细胞株SKOV3，细胞培养24 h后留作后续实验。
1.3 细胞Transwell测定用miR-142-3p模拟物或HMGA2过表达载体转染细胞或用miR-142-3p抑制剂预处理细胞。48 h后细胞在血清剥夺培养基中培养12 h，用胰蛋白酶消化，然后接种在24孔透孔培养基（Promega）的顶部培养室中。在培养基中加入20%血清作为下腔的化学吸引剂。24 h后用4%甲醛固定细胞10 min，然后用0.005%结晶紫染色，相差显微镜下计数。
1.4 实时荧光定量PCR测定取约0.2 g组织，放入有少许液氮的研钵中，加入Trizol研碎，提取总RNA，mRNA逆转录，以U6为内参，进行PCR反应。实验中所用的引物序列如下：HMGA2上游引物：5’-CTCAAAAGAAAGCAGAAGC CACTG-3’，反向引物：5’-TGAGCAGGCTCTTCTGAA CAACT-3’；miR-142-3p茎环引物5’-CTCAACTGGTG TCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCATAAA-3’，上游引物：5’ -CTCCAGCTGGGTGTAGTGTTTCCTAC TT -3’，反向引物：5’ -GTCGTGGAGTCGGCAAT-3’；U6茎环引物5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACAAAATATGGAAC- 3’，上游引物：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAG C-3’，反向引物：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。
1.5 Western blotting在细胞培养皿加入蛋白裂解液，用枪头反复抽打，裂解20 min后，将蛋白裂解液移至1.5 mL EP管中，4 ℃高速离心15 min后取上清液，采用BCA法检测样品蛋白浓度，用裂解液配平。加入5×上样缓冲液煮沸，进行蛋白变性8 min。上样进行电泳，浓缩胶80 V 40 min，分离胶120 V 80 min，转膜100 V 60 min，将蛋白转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h后，一抗anti-HMGA2（1:500，美国Santa Cruz公司）、GAPDH（1:2 000，美国Santa Cruz公司）4 ℃孵育过夜；室温TBST洗3次，5 min/次，加入HRP兔抗二抗（1:1 000），室温孵育1 h；TBST洗3次，5 min/次；ECL发光液发光。计算成像后蛋白条带灰度值。
1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，数据采用x±s表示，2组间比较采用LSD法，多组间比较采用ANOVA分析，P < 0. 05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 miR-142-3p在卵巢癌组织的表达情况结果显示，miR-142-3p在卵巢癌组织表达为0.42±0.12，癌旁正常组织表达为0.98±0.15，二者比较有统计学差异（P < 0.01）。HMGA2在卵巢癌组织的表达为0.97±0.13，癌旁正常组织的表达为0.52±0.16，二者比较有统计学差异（P < 0.01）。Pearson相关分析表明卵巢癌组织中miR-142-3p表达与HMGA2 mRNA表达呈负相关（r = -0.707 4，P < 0.05）。利用Target Scan和mi Target等软件进行生物学分析，结果发现miR-142-3p与HMGA2的3’-UTR结合，见图 1。
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| A, Pearson correlation analysis results; B, bioinformatics predicts the binding sites of miR-142-3p and HMGA2. 图 1 miR-142-3p靶基因预测结果 Fig.1 Prediction of target genes of miR-142-3p |
2.2 miR-142-3p过表达抑制SKOV3细胞的迁移和侵袭
采用miR-142-3p过表达载体（miR-142-3p模拟物）转染SKOV3细胞，或用miR-142-3p的抑制剂预处理48 h。结果显示，与miR-142-3p模拟物交叉感染后，miR-142-3p表达显著增加；而抑制剂预处理明显抑制了miR-142-3p表达（表 1）。在Transwell实验中，miR-142-3p过表达导致SKOV3细胞迁移和侵袭显著抑制；与干扰组比较，miR-142-3p抑制剂处理增强了SKOV3细胞迁移和侵入。见表 1、图 2。本研究结果表明，体外miR-142-3p表达增强对卵巢癌细胞迁移和侵袭具有抑制作用。
| Group | miR-142-3p mRNA | SKOV3 cell migration | SKOV3 cell invasion |
| Scramble | 1.10±0.10 | 82±8.0 | 43±3.0 |
| Mimics | 7.20±0.801） | 25±3.01） | 18±1.51） |
| Inhibitor | 0.24±0.021），2） | 112±10.01），2） | 62±5.41），2） |
| 1）P < 0.05 vs scramble group；2）P < 0.05 vs mimics group. | |||
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| 图 2 miR-142-3p抑制卵巢癌SKOV3细胞的迁移和侵袭×400 Fig.2 miR-142-3p inhibits migration and invasion of ovarian cancer SKOV3 cells ×400 |
2.3 HMGA2逆转miR-142-3p引起的细胞迁移和侵袭
为了确定HMGA2是否参与了miR-142-3p对肿瘤细胞的作用，本研究构建了HMGA2过表达载体，并成功导入SKOV3细胞中。Western blotting检测结果表明，过表达载体转染后，SKOV3细胞中HMGA2表达显著增加。上调HMGA2显著逆转了miR-142-3p诱导的迁移和侵袭抑制，见表 2、图 3。证实HMGA2参与了miR-142-3p介导的卵巢癌细胞生长调节。
| Group | SKOV3 cell migration | SKOV3 cell invasion |
| Scramble | 72±6.8 | 47±7.8 |
| Mimics | 25±2.41） | 18±2.01） |
| Mimics+HMGA2 | 60±5.82） | 40±3.22） |
| 1）P < 0.05 vs scramble group；2）P < 0.05 vs mimics group. | ||
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| A, HMGA2 protein expression; 1, scramble group; 2, mimics group; 3, mimics+HMGA2 group; B, SKOV3 cell migration and invasion. 图 3 HMGA2过表达抑制miR-142-3p诱导的细胞迁移和侵袭×400 Fig.3 Overexpression of HMGA2 inhibits miR-142-3p induced cell migration and invasion ×400 |
2.4 过表达miR-142-3p降低HMGA2的表达
结果显示，对照组、NC组、模拟组SKOV3细胞中HMGA2 mRNA表达分别为1.0±0.11，1.0±0.09，0.4±0.03。与对照组比较，模拟组SKOV3细胞中HMGA2 mRNA表达明显下调（P < 0.05）；HMGA2蛋白表达也明显下调，见图 4。
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| 1, control group; 2, NC group; 3, mimics group. 图 4 SKOV3细胞中HMGA2蛋白表达 Fig.4 HMGA2 protein expression in SKOV3 cells |
3 讨论
研究[10]显示，卵巢癌生存率较低，可能与卵巢癌恶性程度及复杂的生物学特征有关。很多肿瘤形成的相关因子与卵巢癌的发展有关，但其发病机制仍未阐明[11]。miR-142发现于造血细胞[12]，DUDEK等[13]研究结果表明，mir-142-3p是一种新的β-连环蛋白抑制剂，有可能是未来肿瘤治疗的候选靶点。有研究[14]报道在子宫颈癌细胞中miR-142-3p能够通过作用FZD7抑制细胞的增殖和侵袭。
miR-142-3p作为抑癌因子在多种肿瘤组织或细胞系中表达下调，本研究比较了卵巢癌患者标本与癌旁组织中miR-142-3p表达水平，发现miR-142-3p在卵巢癌组织中表达明显低于癌旁组织，提示miR-142-3p可能是抑癌因子，能够发挥抑癌作用。结果又发现过表达miR-142-3p能够显著抑制SKOV3细胞的迁移和侵入能力，表明miR-142-3p具有抑制卵巢癌细胞侵袭和迁移的作用。
每一个miRNA通常会作用多个靶基因，通过对其调控而发挥不同的生物学功能。本研究通过生物信息学方法预测miR-142-3p结合HMGA2 mRNA的3’UTR。HMGA2高度表达于胚胎发育过程中，在很多成熟和分化的组织中几乎不表达。有研究[15]发现，多种人恶性肿瘤中高表达HMGA2，HMGA2参与肿瘤细胞的不同活动。HMGA2过表达与乳腺癌和胰腺癌肿瘤等发生、发展有关[16-17]。已有文献报道HMGA2参与肿瘤（卵巢癌[18-19]等）发生的不同步骤，本研究结果显示，HMGA2与miR-142-3p在卵巢癌组织中的表达呈负相关，与以往研究结果一致。
本研究将miR-142-3p模拟物转染SKOV3细胞中，发现SKOV3细胞的侵袭和迁移能力均下降；Transwell小室实验结果表明HMGA2能够降低miR-142-3p对卵巢癌细胞侵袭和迁移的抑制作用。说明miR-142-3p可能通过下调HMGA2基因来抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移，而HMGA2能够增强肿瘤细胞的侵袭和迁移。
综上所述，miR-142-3p表达增加能够抑制SKOV3细胞中HMGA2 mRNA和蛋白表达，并抑制SKOV3细胞的生长和转移。本研究对卵巢癌细胞迁移和侵入的机制进行了探讨，为临床治疗卵巢癌提供了理论依据。
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