中国医科大学学报  2019, Vol. 48 Issue (8): 747-751, 755

文章信息

吕男男, 高芸, 单忠艳
LÜ Nannan, GAO Yun, SHAN Zhongyan
肿瘤坏死因子-α通过诱导上皮间质转化促进乳头状甲状腺癌细胞的侵袭转移
Tumor Necrosis Factor-α Induces Malignant Progression through Epithelial Mesenchymal Transition in Papillary Thyroid Cancer Cell Line
中国医科大学学报, 2019, 48(8): 747-751, 755
Journal of China Medical University, 2019, 48(8): 747-751, 755

文章历史

收稿日期:2018-05-16
网络出版时间:2019-07-15 10:29
肿瘤坏死因子-α通过诱导上皮间质转化促进乳头状甲状腺癌细胞的侵袭转移
吕男男1,2 , 高芸1 , 单忠艳1     
1. 中国医科大学附属第一医院内分泌科, 内分泌研究所, 沈阳 110001;
2. 沈阳市第四人民医院内分泌科, 沈阳 110032
摘要目的 观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对乳头状甲状腺癌(PTC)细胞株TPC-1侵袭转移的影响,并探讨上皮间质转化(EMT)在其中的作用。方法 采用划痕愈合实验和transwell侵袭实验检测TNF-α对TPC-1侵袭转移能力的影响;实时定量PCR和免疫印记检测EMT标志物E-cadherinN-cadherinVimentin的mRNA及蛋白水平变化。采用免疫荧光检测上述标志物的定位表达。结果 划痕愈合实验和transwell侵袭实验结果显示,在TNF-α诱导下,TPC-1的侵袭转移能力明显增强(P < 0.05);实时定量PCR结果显示,EMT的上皮标志物E-cadherin mRNA表达水平明显下降,间质标志物N-cadherin mRNA表达上调,而Vimentin mRNA上调不明显。免疫印记结果表明,E-cadherin蛋白表达水平下降,N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平上升(P < 0.05)。免疫荧光结果显示,E-cadherin和Vimenin定位于细胞质,N-cadherin定位于细胞膜,且在TNF-α作用下,E-cadherin表达水平明显下降,N-cadherin和Vimenin表达水平上调。结论 TNF-α可以通过诱导EMT促进TPC-1侵袭转移,提示TNF-α在人PTC的侵袭转移中发挥重要作用。
关键词肿瘤坏死因子-α    侵袭    转移    乳头状甲状腺癌    上皮间质转化    
Tumor Necrosis Factor-α Induces Malignant Progression through Epithelial Mesenchymal Transition in Papillary Thyroid Cancer Cell Line
LÜ Nannan1,2 , GAO Yun1 , SHAN Zhongyan1     
1. Department of Endocrinology, The Endocrine Institute and The Liaoning Provincial Key Laboratory of Endocrine Diseases, The First Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China;
2. Department of Endocrinology, The 4th People's Hospital of Shenyang, Shenyang 110032, China
Abstract: Objective To investigate the effects of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) on the migration and invasion of the papillary thyroid cancer (PTC) cell line, TPC-1, and to confirm the involvement of epithelial-mesenchymal transition (EMT) mechanism in these progressions. Methods The effect of TNF-α on cell migration and invasion was assessed by wound-healing and transwell assays. The expression levels of mRNAs and EMT marker proteins, E-cadherin, N-cadherin, and Vimentin, were analyzed using RT-PCR and Western blotting. Their distributions were detected by immunofluorescence. Results The wound-healing and transwell assays revealed increased migratory and invasive abilities of PTC cells treated with TNF-α (P < 0.05). RT-PCR displayed a decrease in E-cadherin mRNA level, whereas mRNA level of N-cadherin showed an increase; no apparent increase was observed in mRNA of Vimentin. Western blotting demonstrated a decrease in E-cadherin expression and an increase in N-cadherin and Vimentin expression (P < 0.05). The results were further confirmed by immunofluorescence analysis. Conclusion EMT may be involved in the malignant tumor progression induced by TNF-α in PTC cell line. The inflammation may participate in the invasion and metastasis of human papillary thyroid cancer.

目前,甲状腺癌已成为全球范围内患病率上升最快的实体肿瘤,美国1974至2013年间甲状腺癌发病率平均每年增加3.6%,主要与乳头状甲状腺癌的增加有关[1]。乳头状甲状腺癌通常分化良好,但伴有侵袭性生长或远处转移者5年生存率仅为40%[1-3]。研究[4-5]发现,上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)参与多种肿瘤的侵袭与转移。EMT是上皮细胞失去其极性结构获得间质细胞特性,进而改变细胞间链接状态,允许细胞运动的过程。其特征性变化为细胞连接的组分E-钙黏蛋白表达的缺失,以及间质细胞成分N-钙黏蛋白的过度表达,从而使细胞获得移动能力。促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),是肿瘤微环境及自身免疫性疾病中重要的炎症介质,在许多实体肿瘤及肿瘤微环境中高表达[6]。TNF-α能否促进乳头状甲状腺癌侵袭转移目前尚不清楚。因此,本研究拟通过观察TNF-α对乳头状甲状腺癌细胞系TPC-1增殖和转移的影响,探讨EMT在此过程中所发挥的作用。

1 材料与方法 1.1 材料

人重组TNF-α购自美国Invitrogen公司;一抗(E-cadherin,N-cadherin,Vimentin)购自美国Santa Cruz生物技术公司;乳头状甲状腺癌细胞株TPC-1系美国科罗拉多大学内分泌、糖尿病与代谢病科Haugen博士赠予;DMEM培养液和胎牛血清购自美国GIBCO公司;transwell小室购自美国Corning公司;Matrigel基质胶/基质膜及荧光一抗购自美国BD公司;Alexa Fluor 594标记荧光二抗购自美国Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组

将TPC-1细胞置于37℃、5%CO2培养箱中,用含10%胎牛血清及青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μg/mL)的高糖DMEM培养液进行培养,每24 h换液1次。待细胞呈单层贴壁生长,0.25%胰蛋白酶消化传代。将TPC-1细胞随机分为TNF-α处理组和对照组,向TNF-α处理组细胞培养液中加入终浓度为20 ng/mL的TNF-α,36 h后弃除培养液,用于后续实验;对照组则不做任何处理。

1.2.2 细胞体外迁移能力实验

消化TNF-α处理组和对照组细胞,接种至12孔板(每组6孔),数量以贴壁后铺满板底为宜。用10 μL微量加样器垂直于孔板制造细胞划痕,尽量保证各划痕宽度一致。吸去细胞培养液,用PBS冲洗孔板3次,洗去划痕产生的细胞碎片。加入无血清培养基,拍照记录。将培养板放入培养箱内,每隔4~6 h取出拍照。实验重复3次。

1.2.3 细胞体外侵袭能力实验

用50 mg/L的Matrigel胶1︰7稀释包被transwell小室(孔径为8.0 μm)底部的上室面,用DMEM培养液(不含10%胎牛血清,含1%牛血清白蛋白)重悬细胞后制成1×105/ml的细胞悬液,按每室0.5 mL接种于transwell侵袭室的上层,继续培养36 h。取出上层的小室,去除基质膜上未侵袭转移细胞,HE染色后显微镜下随机取6个高倍(×400)视野,计数穿过基质胶的细胞数。实验重复3次。

1.2.4 实时PCR检测

E-cadherinN-cadherinVimentin mRNA表达水平:按照Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书提取细胞总RNA,应用RNA反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit,日本TaKaRa公司)将1 μg总RNA反转录为cDNA,反应体系为20 μL。E-cadherin正义引物序列为5’-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3’,E-cadherin反义引物序列为5’-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3’;N-cadherin正义引物序列为5’-GAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3’,N-cadherin反义引物序列为5’-GTGTATGTGGCAA TGCGTTC3’;Vimentin正义引物序列为5’-GAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3’,Vimentin反义引物序列为5’-GCTTCCTGTAGGTGGCAATC-3’;内参照GAPDH正义引物序列为5’-ACCCAGAAGAC TGTGGATGG-3’,GAPDH反义引物序列为5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3’。应用SYBR® Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒(日本TaKaRa公司),于Light cycle480实时定量PCR仪对反转录产物进行扩增。结果应用LightCycler480 1.5软件进行分析。

1.2.5 Western blotting检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平

将处于对数生长期的TNF-α处理组和对照组细胞按1×l06/孔接种于6孔板,培养36 h后弃掉培养液,用预冷的PBS洗2次,蛋白裂解液冰上裂解细胞30 min,提取蛋白,BCA法蛋白定量。按每孔50 μg蛋白上样,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,80 mV恒压转膜1~3 h,5%脱脂奶粉封闭l h。加入一抗(1︰750),4 ℃摇床过夜。漂洗后加入碱磷酸酶标记的二抗(1︰5 000),孵育1 h。化学发光,显影,压片,灰度扫描。

1.2.6 细胞免疫荧光

在铺有细胞爬片的6孔板中培养细胞,培养液中加入终浓度为20 ng/mL的TNF-α处理36 h,待细胞生长融合至95%~100%时,弃除培养液。4%多聚甲醛冰上固定20 min,0.1%TritonX-100覆盖细胞,室温静置5 min,加入1%牛血清白蛋白稀释的一抗(E-cadherin 1︰200稀释,N-cadherin 1︰200稀释,Vimentin 1︰50稀释),4 ℃孵育过夜,洗涤,加入PBS稀释荧光二抗(1︰400),室温避光孵育60 min,DAPI覆盖细胞表面,室温避光静置2 min,封片,4 ℃避光保存备用。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。计量资料采用x±s表示,均数之间的比较采用单因素方差分析LSD法,方差不齐者采用Dunnett’s T3法。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 TNF-α处理后乳头状甲状腺癌TPC-1细胞迁移能力变化

TNF-α(20 ng/mL)作用36 h后行细胞划痕实验,结果显示,经过24 h爬行,TNF-α处理组TPC-1细胞迁移能力与对照组相比提高了约2倍(P < 0.01),见图 1

*P < 0.01 vs control. Bar=100 μm. 图 1 TNF-α对TPC-1细胞迁移能力的影响 Fig.1 Effect of TNF-α on migration of TPC-1 cells

2.2 TNF-α处理后乳头状甲状腺癌TPC-1细胞侵袭转移能力的变化

transwell侵袭实验结果显示,TNF-α处理组细胞的侵袭能力较对照组显著提高,差异有统计学意义(P < 0.01)。见图 2

*P < 0.01 vs control group. 图 2 TNF-α对TPC-1细胞侵袭能力的影响 HE染色×200 Fig.2 Effect of TNF-α on invasion of TPC-1 cells HE×200

2.3 TNF-α对TPC-1细胞EMT标志物mRNA表达水平的影响

实时PCR结果显示,TNF-α处理后,EMT上皮标志物E-cadherin mRNA表达水平较对照组下降(P < 0.01),TNF-α处理12 h时其表达水平约下降至60%~70%;间质标志物N-cadherinVimentin mRNA表达水平升高(P < 0.01),N-cadherin表达最高增加约2倍,而Vimentin表达上调并不明显。见图 3

*P < 0.01 vs control. 图 3 TNF-α对TPC-1细胞EMT标志物mRNA表达的影响 Fig.3 Effect of TNF-α on the mRNA expression of EMT marker in TPC-1 cells

2.4 TNF-α对TPC-1细胞EMT标志物蛋白表达水平的影响

Western blotting结果显示,不同浓度TNF-α作用36 h后,TPC-1细胞中E-cadherin蛋白表达水平下调,N-cadherin蛋白表达水平上调。E-cadherin在TNF-α浓度为10 ng/mL时下调幅度最小,约下调10%,20 ng/mL、40 ng/mL分别下调约55%和59%。不同浓度(10、20、40 ng/mL)TNF-α作用下,N-cadherin上调幅度依次为1.24、2.26、1.57倍,Vimentin上调幅度依次为1.02、2.12、1.20倍。如图 4所示,20 ng/mL、40 ng/mL浓度TNF-α处理的细胞与对照组相比,差异有统计学意义(P < 0.01)。

*P < 0.01 vs control. 图 4 TNF-α对TPC-1细胞EMT标志物蛋白表达水平的影响 Fig.4 Effect of TNF-α on the protein expression of EMT marker in TPC-1 cells

2.5 TNF-α处理后TPC-1细胞EMT标志物定位

细胞免疫荧光结果显示,浓度20 ng/mL TNF-α处理36 h后,TPC-1细胞中N-cadherin主要定位于细胞膜,而E-cadherin和Vimentin主要定位于细胞质,且E-cadherin表达量减少,N-cadherin和Vimentin表达量增加,与Western blotting结果一致。见图 5

图 5 TNF-α处理后EMT标志物蛋白定位情况 细胞免疫荧光染色 ×200 Fig.5 EMT markers protein localization in TPC-1 cells after TNF-α treatment Immunofluorescence staining×200

3 讨论

EMT是上皮细胞在某些因素的作用下,失去极性及细胞间紧密连接和黏附连接,获得了浸润性和游走迁移能力,变成具备间质细胞形态和特性的细胞的改变,与肿瘤的转移密切相关。而转移不仅涉及细胞自身的变化,还和肿瘤微环境息息相关。肿瘤细胞和(或)肿瘤相关免疫细胞及炎症细胞都可产生细胞因子,而这些细胞因子可对肿瘤的转移起直接作用[7-8]。细胞因子TNF-α作为一种重要的炎症介质,在炎症、免疫细胞的激活、细胞内稳态、肿瘤进展等方面都发挥着重要作用。临床上,与健康人相比,癌前病变和恶性肿瘤患者通常会出现TNF-α血清浓度和组织表达水平升高[9]。事实上,已有研究发现人类甲状腺组织可表达编码炎症蛋白的基因,如CXCR4CD44OPNCXCL1CXCL10SDF-1。甲状腺肿瘤中激活的原癌基因,如RET/PTCRASBRAF,可以启动MAPK级联反应,进而促进细胞自发的促炎症转化。一些细胞因子、趋化因子以及它们的受体表达随之升高,这其中也包括TNF-α[10-11]。通过SMAD,NF-κB,AKT/GSK-3β,JAK/STAT等信号通路,长期持续的小剂量TNF-α刺激也可诱导其它肿瘤的侵袭和转移[12-13]

本研究观察了促炎性细胞因子TNF-α对乳头状甲状腺癌TPC-1细胞侵袭转移能力的影响。结果发现,TNF-α不仅增强了TPC-1细胞的迁移和侵袭能力,而且在此过程中出现了EMT的标志性变化,即E-cadherin表达下调,N-cadherin和Vimentin表达上调。未经处理的TPC-1细胞中,E-cadherin呈高表达。LIU等[14]的研究表明,E-cadherin表达于分化良好的甲状腺癌,如乳头状甲状腺癌和滤泡状甲状腺癌中,而在未分化甲状腺癌中则无表达,与本研究结果一致。JENSEN等[15]的研究显示,在TNF-α刺激下,未分化甲状腺癌细胞株WRO中E-cadherin表达下调,而除去TNF-α则使E-cadherin的表达恢复。ROCHA等[16]报道分化良好的甲状腺癌中E-cadherin的下调与不良预后相关。

本研究还观察了另外2个经典的EMT间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达情况,二者的mRNA和蛋白表达水平均在TNF-α刺激后呈现一定程度的上调,但Vimentin的上调幅度较小。E-cadherin的缺失和N-cadherin的增加被称为“钙黏蛋白开关”,并在多种实体肿瘤中代表着EMT的发生[17]。Vimentin是EMT的重要调控因子,同时也在乳头状甲状腺腺癌的EMT中发挥关键作用,它可以独立诱导EMT[18]。以上研究结果为Vimentin参与乳头状甲状腺癌的恶性进展提供了直接依据。

综上所述,TNF-α能够在人乳头状甲状腺癌细胞株TPC-1中诱导EMT,并增强人乳头状甲状腺癌的侵袭转移能力。

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