2019, Vol. 48文章信息
- 陈建康, 严瑜, 潘晓莉, 周密, 张文泉, 杨洁, 朱鹏立
- CHEN Jiankang, YAN Yu, PAN Xiaoli, ZHOU Mi, ZHANG Wenquan, YANG Jie, ZHU Pengli
- 膜联蛋白A1及其模拟肽Ac2-26对高糖诱导大鼠心肌细胞炎症反应的影响
- Effect of Annexin A1 and Mimetic Peptide Ac2-26 on Inflammatory Response in Cardiac Myocytes Induced by High Glucose in Rats
- 中国医科大学学报, 2019, 48(8): 730-733
- Journal of China Medical University, 2019, 48(8): 730-733
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文章历史
- 收稿日期：2018-11-23
- 网络出版时间：2019-07-15 10:45
引用本文 |
2型糖尿病病程长，易导致心、脑、肾、血管等器官发生并发症。糖尿病心肌病变是主要并发症之一，以心力衰竭为主要表现，严重可导致患者死亡。糖尿病心肌病变机制尚未明确，目前多认为与氧化应激、炎症反应、细胞死亡、自噬等有关[1]。炎症反应是糖尿病导致心肌病变的重要原因之一，已有研究[1-3]证实炎症反应可以使氧化应激活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）增加，促进粒细胞、单核细胞等炎症细胞的聚集和迁移，增加炎症复合物形成，刺激炎性细胞因子[肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等]分泌，增加转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表达，从而导致心肌细胞损伤，进一步造成心肌重塑，形成糖尿病心肌病变。目前，一些研究[2-6]表明通过抑制炎症反应可改善糖尿病心肌病变。
已有研究[7-8]表明膜联蛋白A1是重要的抗炎物质，它通过抑制磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）来减少炎症反应复合物形成；抑制炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β等）分泌，改善炎症反应。模拟肽Ac2-26是膜联蛋白A1的小分子片段，由体外获得，具有与膜联蛋白A1相似生物学效应[9]。本课题组前期研究[10]发现膜联蛋白A1改善糖尿病大鼠心功能可能与炎症反应有关。本研究通过体外研究探讨膜联蛋白A1及模拟肽Ac2-26对高糖诱导的大鼠心肌细胞炎症反应的影响。
1.1 材料与方法 1.1 实验动物、仪器及试剂出生3 d内的清洁级SD大鼠购于福建省医学科学研究院动物中心[动物质量许可证号：SYXK（闽）2017-0011]，雌雄不限。主要仪器和试剂：TP800型实时荧光定量PCR仪（日本TaKaRa公司）、超净工作台（常州普天仪器制造有限公司）、CO2培养箱（德国科峻公司）、流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）、DMEM培养基（美国Gibco公司）、总RNA抽提试剂盒（上海飞捷生物技术有限公司）、逆转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；兔抗大鼠TNF-α、IL-1β（南京建成生物工程研究所），模拟肽Ac2-26（美国Santa Cruz公司）。
1.2 方法 1.2.1 心肌细胞制备取6只大鼠置于超净工作台上，取其心室肌组织，4 ℃D-Hanks液洗净，用细组织剪刀剪碎心室肌组织，0.1%胰蛋白酶消化为单细胞悬液，细胞差速贴壁1.5 h后，用含100 mL/L胎牛血清DMEM培养液使未贴壁心肌细胞稀释成5×10-5/L，应用0.1 mmol/Brdu抑制培养基中非心肌细胞增殖，然后将心肌细胞接种在6孔板中，每孔为2 mL，置于37 ℃细胞培养箱中继续孵育48 h，换成无血清培养液对心肌细胞进行处理。
1.2.2 实验分组及干预根据预实验结果，Ac2-26浓度以0.1 mg/mL作为标准剂量干预。将分离的大鼠原代心肌细胞培养48 h后换液，在倒置显微镜下观察心肌细胞长势，待其细胞长至90%融合时，将细胞随机分组：正常对照组[葡萄糖（5.5 mmol/L）DMEM培养基进行培养]、正常干预组[葡萄糖（5.5 mmol/L）DMEM培养基、Ac2-26（0.1 mg/mL）进行培养]、高糖模型组[葡萄糖（30 mmol/L）DMEM培养基进行培养）]、高糖治疗组[葡萄糖（30 mmol/L）DMEM培养基、Ac2-26（0.1 mg/mL）进行培养]。各组细胞均继续培养48 h后收集细胞。
1.2.3 TNF-α、IL-1β检测收集各组细胞上清液，按照试剂盒步骤采用ELISA法测定TNF-α、IL-1β水平。
1.2.4 实时PCR检测膜联蛋白A1及PLA2 mRNA表达原代心肌细胞培养结束后，各培养皿用PBS洗2遍，裂解细胞，提取总RNA及cDNA，按Trizol法提取总RNA，参照说明书对膜联蛋白A1及PLA2进行逆转录和PCR扩增，膜联蛋白A1正反引物序列分别为5’-TCGCAATGAAGGACGATAG-3’和5’-ATATCCTCTTACAGTC-3’，扩增长度分别为307 bp、318 bp，PLA2正反引物序列分别为5’-TCTGTCCAATGACGGAGTC-3’和5’-CTAGTCCAGATTTCTGCCCGTACG-3’，扩增长度分别为296 bp、301 bp，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶拍照系统自动拍照，最后对图像进行分析。
1.3 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计分析，所有数据采用x±s表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果结果显示，与正常对照组比较，正常干预组膜联蛋白A1、PLA2 mRNA表达，TNF-α、IL-1β水平下降，但差异无统计学意义（P > 0.05）。与正常对照组比较，高糖模型组膜联蛋白A1及PLA2 mRNA表达，TNF-α、IL-1β水平显著上升，差异有统计学意义（P < 0.01）。与高糖模型组比较，高糖治疗组PLA2 mRNA表达，TNF-α、IL-1β水平明显下降，差异有统计学意义（P < 0.01）；而膜联蛋白A1 mRNA表达下降，但差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 1，表 1、2。
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| 1, control group; 2, normal intervene group; 3, high glucose group; 4, high glucose treatment group. 图 1 各组膜联蛋白A1及PLA2 mRNA表达 Fig.1 Expression of Annexin A1 and PLA2 mRNA in each group |
| Group | n | Annexin A1 mRNA | PLA2 mRNA |
| Control | 5 | 15.29±1.34 | 18.88±2.23 |
| Normal intervene | 5 | 14.09±1.23 | 17.09±2.01 |
| High glucose | 5 | 38.24±3.241） | 65.38±5.631） |
| High glucose treatment | 5 | 35.12±3.15 | 22.68±2.532） |
| 1）P < 0.01 compared with control group；2）P < 0.01 compared with high glucose group. | |||
| Group | n | TNF-α | IL-1β |
| Control | 5 | 23.18±5.05 | 15.38±3.53 |
| Normal intervene | 5 | 21.28±4.65 | 14.68±3.33 |
| High glucose | 5 | 123.28±8.351） | 96.78±7.531） |
| High glucose treatment | 5 | 33.28±6.252） | 28.38±3.832） |
| 1）P < 0.01 compared with control group；2）P < 0.01 compared with high glucose group. | |||
3 讨论
研究[11]显示，糖尿病可以诱发心力衰竭发作或者促进其发展，糖尿病心肌病是非缺血性心肌病的重要病因。既往研究[12]表明糖尿病病程进展中伴随着炎症反应，特别在形成并发症时炎症反应始终参与其中，糖尿病心肌病病变过程中伴随着炎症反应增强。因此通过抑制炎症反应可以改善糖尿病心肌病[2]。
膜联蛋白A1是膜联蛋白超家族中的一员，依赖钙离子与细胞膜磷脂结合，又称为依钙蛋白、磷脂酶A2抑制蛋白，大部分器官、组织均可以表达，在粒细胞/单核细胞中呈更高水平表达。膜联蛋白A1是外周系统重要的抗炎物质，改善机体炎症反应。既往对于膜联蛋白A1研究多集中在感染、肿瘤等方面，近年有些研究[13-16]表明膜联蛋白A1与心脑血管疾病（动脉粥样硬化、心肌再灌注损伤、冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑梗死、机体脏器纤维化等）也有密切关系。模拟肽Ac2-26是膜联蛋白A1裂解的小分子片段，同样具有强大的抗炎活性，可以改善心肌梗死、抑制小胶质细胞释放炎症介质[17-18]。PLA2是炎症复合物、炎症介质合成释放的关键酶，在炎症反应过程中发挥重要作用；炎性细胞因子TNF-α、IL-1β主要由单核-巨噬细胞分泌，同样在炎症反应发挥重要作用。本研究采用高糖负荷心肌细胞，模拟糖尿病对心肌病变的影响。结果显示，与正常对照组比较，正常干预组膜联蛋白A1、PLA2 mRNA表达，TNF-α、IL-1β水平没有统计学差异（均P > 0.05），说明Ac2-26干预效果有限，同样对膜联蛋白A1影响不明显；而在高糖模型组膜联蛋白A1及PLA2 mRNA表达，TNF-α、IL-1β水平都明显上升（均P < 0.05），说明糖尿病病程中存在明显炎症反应，膜联蛋白A1抗炎作用明显增加。与高糖组比较，高糖治疗组PLA2 mRNA表达，TNF-α、IL-1β水平明显下降（均P < 0.05），提示Ac2-26改善了高糖诱导的心肌细胞的炎症反应，但膜联蛋白A1下降不明显，进一步证实了Ac2-26对膜联蛋白A1影响有限，同时膜联蛋白A1维持较高水平继续发挥抗炎作用。既往研究[14]表明膜联蛋白A1及Ac2-26在体内、体外对缺血再灌注心肌损伤均具有改善作用，本研究证实膜联蛋白A1与高糖诱导心肌细胞的炎症反应关系密切，Ac2-26能够明显减轻炎症反应。推测其机制可能是Ac2-26通过抑制PLA2表达使花生四烯酸、前列腺素、血小板活化因子等炎症活性物质分泌减少，减轻炎症反应，同时抑制PLA2表达后抑制了中性粒细胞表面整合素和脂多糖的表达，使TNF-α、IL-1β分泌减少；另外Ac2-26抑制单核细胞、巨噬细胞等趋化、聚集功能，下调炎性细胞因子TNF-α、IL-1β表达来改善炎症反应。
综上所述，膜联蛋白A1与高糖诱导心肌细胞炎症反应明显相关，模拟肽Ac2-26改善了高糖诱导的心肌细胞炎症反应，推测在体内同样可以改善糖尿病大鼠心肌病变，本研究为模拟肽Ac2-26治疗糖尿病心肌病提供了实验依据。
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