新皮质的微小损伤对阿尔茨海默病模型小鼠学习能力的影响

http://dx.doi.org/10.12007/j.issn.0258-4646.2019.08.006

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邹敬宇, 班允超, 徐晓鹤, 包义君, 吴安华

ZOU Jingyu, BAN Yunchao, XU Xiaohe, BAO Yijun, WU Anhua

Impairment of Minimal Neocortical Injury on Learning Ability in Alzheimer Disease Model Mice

中国医科大学学报, 2019, 48(8): 699-702

Journal of China Medical University, 2019, 48(8): 699-702

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收稿日期：2019-06-18

网络出版时间：2019-07-15 10:15

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邹敬宇, 班允超, 徐晓鹤, 包义君, 吴安华. 新皮质的微小损伤对阿尔茨海默病模型小鼠学习能力的影响[J]. 中国医科大学学报, 2019, 48(8): 699-702.

ZOU Jingyu, BAN Yunchao, XU Xiaohe, BAO Yijun, WU Anhua. Impairment of Minimal Neocortical Injury on Learning Ability in Alzheimer Disease Model Mice[J]. Journal of China Medical University, 2019, 48(8): 699-702.

新皮质的微小损伤对阿尔茨海默病模型小鼠学习能力的影响

邹敬宇¹ , 班允超¹ , 徐晓鹤² , 包义君¹ , 吴安华¹

1. 中国医科大学附属第一医院神经外科, 沈阳 110001;
2. 中国医科大学附属盛京医院眼科, 沈阳 110004

收稿日期：2019-06-18；网络出版时间：2019-07-15 10:15

基金项目：国家自然科学基金青年基金（81701048）

作者简介：邹敬宇(1982-), 男, 主治医师, 博士.

通信作者：邹敬宇, E-mail:zaizen.keiu@yahoo.com.

摘要：目的评估新皮质的微小损伤对阿尔茨海默病模型小鼠学习能力的影响。方法选取4~5月龄阿尔茨海默病模型雄性三转基因APP/PS1/tau小鼠（3xTg）和野生小鼠各20只，分为4组。应用脑立体定向仪，在皮质表面以下1 mm注入谷氨酸钠或生理盐水。通过Morris水迷宫检测空间学习能力；ELISA测定海马可溶性β-淀粉样蛋白（Aβ）水平；长时程增强（LTP）评估海马可塑性。结果 Morris水迷宫实验结果显示，与野生小鼠相比，3xTg小鼠学习成绩差（P < 0.01）；二次水迷宫测试结果显示，3xTg小鼠生理盐水对照组学习成绩明显改善，而3xTg小鼠谷氨酸钠注射组学习成绩无改善，2组存在统计学差异（P < 0.05）。LTP、ELISA结果表明，3xTg小鼠生理盐水对照组在高频刺激后30 min内兴奋性突触后电位（fEPSP）的斜率显著高于3xTg小鼠谷氨酸钠注射组（P < 0.05）；3xTg小鼠谷氨酸钠注射组海马内可溶性Aβ显著增加（P < 0.05）。结论新皮质的微小损伤可损害阿尔茨海默病模型小鼠学习能力。其导致海马内可溶性Aβ显著增加的机制有待进一步研究。

关键词：阿尔茨海默病脑外伤学习与记忆 Morris水迷宫长时程增强

Impairment of Minimal Neocortical Injury on Learning Ability in Alzheimer Disease Model Mice

ZOU Jingyu¹ , BAN Yunchao¹ , XU Xiaohe² , BAO Yijun¹ , WU Anhua¹

1. Department of Neurosurgery, The First Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China;
2. Department of Ophthalmology, Shengjing Hospital, China Medical University, Shenyang 110004, China

Abstract: Objective To evaluate the effect of minimal neocortical injury on learning and memory in Alzheimer disease model mice. Methods Twenty 4-5 month 3xTg AD mice were randomly divided into glutamate injection (3xTg+G) group and saline injection (3xTg+S) group; twenty wild type mice in the same background were in the group of (WT+G) and (WT+S). Sodium glutamate or saline was injected into the cortex 1 mm below the surface of the cortex by using brain stereotaxic apparatus for each group. Spatial learning ability was measured by Morris water maze, soluble Aβ level in hippocampus was measured by ELISA, and hippocampal plasticity was assessed by long-term potentiation (LTP). Results Morris water maze test showed that compared with wild mice, the learning performance of 3xTg mice was worse (P < 0.01). Secondary water maze test showed that the learning performance of 3xTg mice in saline control group was significantly improved, while 3xTg mice in sodium glutamate injection group was not improved, and there was significant difference between the two groups (P < 0.05). The results of LTP showed that the slope of fEPSP in the saline control group of 3xTg mice was significantly higher than that in the sodium glutamate injection group of 3xTg mice within 30 minutes after high frequency stimulation (P < 0.05);ELISA showed the soluble Aβ in the hippocampus of 3xTg mice was significantly increased in the sodium glutamate injection group (P < 0.05). Conclusion Small damage to the neocortex may impair the learning ability of mice with Alzheimer disease. The mechanism of the significant increase of soluble Aβ in hippocampus remains to be further studied.

Keywords: Alzheimer disease traumatic brain injury learning and memory Morris water maze long-term potentiation

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种进行性发展的神经系统退行性疾病^[1], 占痴呆病例的60%~70%^[2], 目前公认的病理生理特征为淀粉样蛋白的沉积和神经纤维缠结及神经细胞凋亡^[3]。然而, 认知能力与斑块的积累并非总是密切相关^[4]。无论是AD患者还是AD模型小鼠, 在淀粉样蛋白斑块出现之前, 通常就已经出现了学习能力的损害^[5]。越来越多的研究^[6]表明, 在形成淀粉样沉积前, 可溶性的β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)在AD的病理进程中发挥着重要作用, 尤其是AD早期阶段。脑外伤(traumatic brain injury, TBI)是导致AD的危险因素^[7], 并且可以加速AD的病理进程, 降低AD的发病年龄^[8]。有研究^[9]表明, TBI或运动相关的脑损伤可加速AD样神经病理学的改变。与无损伤的大脑相比, 受损的大脑内不溶性Aβ沉积物更多。在3xTg-AD模型小鼠中, TBI小鼠提前出现了AD样病理学的改变^[10]。而TBI是否可导致可溶性Aβ增加, 从而导致行为学改变以及突触和神经元功能受损, 尚无报道。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

20只C57BL/6雄性小鼠(WT), 20只三转基因APP/PS1/tau雄性小鼠(3xTg), 4~5月龄, 由日本金泽医科大学生理学Ⅰ实验室惠赠。各随机分为2组(n = 10), 分别标记为WT组和3xTg组。距前囟和顶枕点连线中点左右两侧2.0 mm处, 用直径为0.6 mm的电钻钻开颅骨, 使用汉密尔顿1 μL注射器, 在双侧皮质表面以下1.0 mm处注入0.25 μmol/L谷氨酸钠(glutamate, Glu)或生理盐水0.2 μL。

1.1.2 主要试剂及仪器

Glu, Morris水迷宫及视频软件, 震荡切片机, 玻璃电极控制仪, 恒流泵, 恒温浴槽, 电子天平, 生理信号采集记录分析系统。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宫实验

本研究采用经典Morris水迷宫实验方法^[11]。应用圆形恒温水池(直径150 cm, 高50 cm), 水温(25±1) ℃; 在第2象限正中放置直径9 cm、低于水面1 cm的圆形平台, 距离水池边缘约30 cm, 各象限的池壁中点处上方分别放置红、绿、蓝、黄色的模型作为小鼠寻找平台的参照物。实验期间, 保持圆形平台和4个参照物的位置不变。

连续5 d进行定位航行实验, 每日下午1次, 在4个象限中点处作为入水点, 将小鼠面向池壁置入水中, 记录1 min内找到平台的时间, 如1 min内小鼠仍未找到平台, 则将小鼠人为放置于平台, 停留1 min。每次入水实验间隔休息30 s, 将小鼠拭干。在第5天实验结束后撤去平台, 设置同样的参数进行空间探索实验, 任选一处入水, 测量小鼠穿越平台所在位置的次数, 停留时间及游动距离。尾静脉注射, 7 d后再进行Morris水迷宫实验。第1组小鼠完成注射2周后行Morris水迷宫实验。另一组小鼠在Morris水迷宫实验后进行注射, 2周后进行第2次水迷宫实验。

1.2.2 小鼠海马脑片细胞外记录场兴奋性突触后电位(field exciatatory postsynaptic potential, fEPSP)

配置好使用的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)和切片液, 装有切片的烧杯至于冰水混合物中, 小鼠断头取脑, 置入切片液中5 min, 取出脑组织, 分离海马及相连皮质, 用低浓度琼脂将组织固定于备好的琼脂块胶皿中, 切片液倒入胶皿, 将胶皿固定在振动切片机, 脑片厚度400 μm, 将切好的脑片置入ACSF中, 所有操作均通氧气。使用恒流泵建立有氧的ACSF循环。脑片转至记录槽固定, 刺激电极置于CA3区锥体细胞schaffer侧支, 记录电极(充以1 mol/L NaCl玻璃微电极)置于CA1区锥体细胞树突层130~200 μm。设置参数, 刺激电压为引起最大fEPSP的30%, 基础fEPSP稳定30 min, 稳定后记录5 min, 改为TBS参数, TBS后改为原参数记录fEPSP, 如PS增幅 > 20%, 持续30 min, 视为LTP诱发成功。

1.3 可溶性Aβ1-42的测定

断头取脑, 液氮冻存游离的海马组织, 按脑质量加入相当体积的生理盐水, 用匀浆器将组织研磨, 在冰浴下超声波粉碎制成匀浆, 4 ℃, 10 000 r/min离心10 min, 取上清液备用。上清液用1 mol/L Tris稀释20倍, 中和PH。采用BNT-77/BC-05夹心酶联免疫吸附试验试剂盒说明书(日本Wako Chemical Ltd公司)进行操作。建立标准曲线:试剂盒标准溶液(人Aβ1-42) 20 pmol/L, 然后获得每个脑组织的Aβ1-42的浓度(pmol·L^-1·g^-1)。对于每个样品, 重复测量2次。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行方差分析和t检验, 计量资料采用x±s表示, P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Morris水迷宫测试

与3xTg小鼠相比, WT小鼠逃避潜伏期显著缩短(P < 0.01, 表 1), 将WT和3xTg小鼠每组再分为平均成绩几乎相同的2组, 分别注射谷氨酸钠(WT+G组和3xTg +G组)和生理盐水(WT+S组和3xTg +S组)。与3xTg+S组小鼠相比, 3xTg+G组小鼠逃避潜伏期显著增加(P < 0.05, 表 2), 3xTg+G组小鼠1 min内在平台所在象限停留时间比例(40.64%±1.36%)显著低于3xTg+S组小鼠(48.56%±1.63%) (P < 0.05, n = 10)。而WT+S组小鼠与WT+G组小鼠的逃避潜伏期无统计学差异(P > 0.05, 表 2); WT+S组小鼠(53.74%±1.24%)与WT+G组小鼠(51.58%±1.46%) 1 min内在平台所在象限停留时间比例无统计学差异(P > 0.05, n = 10)。

表 1 各组小鼠逃避潜伏期(x±s, n = 10) Tab.1 Escape latency of mice in each group (x±s, n = 10)

Group	Day1	Day2	Day3	Day4	Day5
WT	45.09±2.33	33.55±3.72¹⁾	23.92±3.47¹⁾	18.73±2.79²⁾	12.22±2.63²⁾
3xTg	48.77±2.56	43.18±3.12	40.21±3.58	39.69±4.39	36.30±4.27
Compared with 3xTg mice, 1) P < 0.05;2) P < 0.01.

表选项

表 2 Glu对各组小鼠逃避潜伏期的影响(x±s, n = 10) Tab.2 Effect of glutamate on escape latency of mice in each group (x±s, n = 10)

Group	Day1	Day2	Day3	Day4	Day5
WT+S	42.96±2.82	29.73±3.88	23.73±3.74	16.60±1.54	9.85±1.37
WT+G	41.45±3.17	30.35±2.97	24.65±3.17	18.55±2.91	12.45±2.50
3xTg+S	43.15±3.28	33.75±2.29¹⁾	29.50±3.04¹⁾	26.55±2.361¹⁾	19.85±1.64¹⁾
3xTg+G	47.70±2.07	40.73±3.23	39.55±3.02	37.28±3.43	32.50±3.69
Compared with 3xTg+G group, 1) P < 0.05.

表选项

2.2 各组海马fEPSP斜率

各组高频强直刺激后成功诱发LTP, 持续记录30 min。3xTg+S组小鼠fEPSP斜率明显高于3xTg+G组小鼠, 差异有统计学意义(P < 0.05)。WT+G组小鼠与WT+S组小鼠fEPSP相比, 斜率无统计学差异(P > 0.05), 见图 1。

图 1 各组小鼠高频强直电刺激前后海马CA1区fEPSP相对最大斜率的比较 Fig.1 Comparison of the field excitatory postsynaptic potential (fEPSP) were recorded in CA1 region of hippocampus

图选项

2.3 DNA微阵列分析

从每组随机选出3只小鼠并取出双侧海马, 进行DNA微阵列分析。注射生理盐水的组与注射Glu的组相比, 有3个基因的表达增加了2倍以上(P < 0.05, n = 3), 1个基因下调2倍以上(P < 0.05, n = 3)。见表 3。

表 3 各组小鼠海马组织DNA微阵列分析结果(n = 3) Tab.3 Results of DNA microarray analysis in hippocampi of mice in each group (n = 3)

Gene	Expression
Proteoglycan 4 (Prg4)	More than 2 folds ↑
RIKEN cDNA 4833420G17 gene (4833420G17Rik)	More than 2 folds ↑
Rho guanine nucleotide exchange factor 10-like (Arhgef101)	More than 2 folds ↑
Uroplakin 1B (Upk1b)	More than 2 folds ↓

表选项

2.4 海马组织内可溶性Aβ1-42测定

为了验证Glu可能导致海马内Aβ1-42增加, 从而导致3xTg小鼠的学习能力恶化, 用酶联免疫吸附实验比较了3xTg+G组小鼠和3xTg+S组小鼠海马可溶性Aβ1-42含量。结果表明, 3xTg+G组(6.037 pmol·L^-1·g^-1)海马内可溶性Aβ1-42显著高于3xTg+S组(4.327 pmol·L^-1·g^-1, t = 2.776, P = 0.020)。

3 讨论

已有研究^[12]显示, TBI可加速Aβ斑块的沉积, 从而加速其认知功能的损害, 然而, TBI是否在早期即引起可溶性Aβ增加, 从而引起认知功能的损害, 目前尚无报道^[13]。因此, 近来越来越多的学者将目光集中到了AD早期细胞内可溶性Aβ的相关研究。

本研究以4~5月龄的3xTg-AD模型小鼠为研究对象, 该月龄小鼠特点为可溶性Aβ已在细胞内聚集, 而细胞外Aβ斑块尚未沉积。结果表明, Glu诱导的微小皮质损伤能够损害3xTg-AD模型小鼠空间学习能力。

通过1次传统的Morris水迷宫实验, 将3xTg小鼠分为成绩相同的2组, 同时将WT小鼠也分为成绩相同的2组, 分别进行Glu损伤注射和生理盐水对照注射, 而后进行重复的Morris实验表明, 3xTg+S组的学习记忆能力明显优于3xTg+G组。而WT+S组与WT+G组无统计学差异。

为了验证Glu诱导3xTg小鼠学习能力恶化的原因, 用酶联免疫吸附实验对比了3xTg+G组和3xTg+S组小鼠海马组织中可溶性Aβ1-42含量, 结果表明, 3xTg+G组学习能力的下降可能与海马组织中可溶性Aβ1-42含量的增加有关。

本研究中, 海马并未直接受到注射损伤, 故推断注射损伤可能产生了某些因子并传递到海马组织, 而Glu引起海马内可溶性Aβ1-42含量增高, 可能也由这些因子造成, 因此本研究进行了DNA微阵列分析。结果表明, 与生理盐水对照组相比, Glu注射组海马组织的Prg4, 4833420G17Rik, Arhgef10基因表达增加了2倍以上(P < 0.05), Upk1b基因表达下降了2倍以上(P < 0.05), 但它们是否与Aβ的增殖和清除存在直接关联目前尚无报道。因此, 这些“可移动的”因子还有待进一步研究。

颅脑损伤与AD的相互作用还存在很多未知因素, 微小颅脑损伤可能加快AD临床前期的发展速度。神经细胞凋亡可上调皮质中某种因子的表达, 该因子通过某种途径转运至海马组织中, 激活Aβ42产生的循环通路, 启动小鼠认知功能障碍。未来将通过体内外实验进一步研究皮质神经细胞凋亡—某因子—Aβ42—小鼠认知功能障碍之间的内在机制。

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