中国医科大学学报  2019, Vol. 48 Issue (7): 657-660

文章信息

李艳秋, 田淑艳, 刘雪, 栗霄丽, 姚丽, 王力宁
狼疮性肾炎小鼠模型的建立及其鉴定
Establishment and Identification of a Lupus Nephritis Mouse Model
中国医科大学学报, 2019, 48(7): 657-660
Journal of China Medical University, 2019, 48(7): 657-660

文章历史

收稿日期:2018-08-21
网络出版时间:2019-07-15 11:05
狼疮性肾炎小鼠模型的建立及其鉴定
中国医科大学附属第一医院肾内科, 沈阳 110001
摘要:观察新西兰黑鼠和新西兰白鼠杂交(NZB×NZW)子一代小鼠发病过程,建立狼疮性肾炎模型,并进行模型鉴定。
关键词狼疮性肾炎    杂交    子一代小鼠    模型建立    
Establishment and Identification of a Lupus Nephritis Mouse Model

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是严重的自身免疫性疾病。SLE使T细胞功能改变和多克隆B细胞活化,伴随自身抗体[抗双链DNA抗体(double strands DNA,dsDNA)等]产生,从而导致多器官免疫复合物沉积。其中,狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)是严重并发症,能导致肾功能损伤。人类SLE/LN表型多样化,临床上规范分组复杂,因此有关SLE研究多利用动物模型来进行。SLE目前有多种动物类型,包括自发性MRL/LPR、BXSB、转基因和基因敲除小鼠[1]。本研究拟观察新西兰黑鼠和新西兰白鼠杂交子一代(NZB×NZW,NZB/W F1)小鼠发病过程,建立LN模型,为将来SLE/LN的研究和治疗提供理想的动物模型。

1 材料与方法 1.1 LN模型建立

30只8周龄NZB/W F1雌性小鼠购自Jackson实验室,30只8周龄雌性C57BL/6小鼠购自维同利华动物有限公司,小鼠均在中国医科大学实验动物部繁殖,按照中国国家标准(GB 14925-2001)指导原则,小鼠生存条件:湿度50%±20%,温度23 ℃±3 ℃,12 h光/12 h暗人工循环,可以自由进食和饮水。本研究获得中国医科大学动物保护和使用委员会批准。所有动物均于SPF级饲养至28~36周。

1.2 LN模型鉴定

1.2.1 体质量测定

每周使用电子台秤测小鼠体质量。

1.2.2 尿蛋白测定

每周对小鼠新鲜尿进行检测。蛋白尿试纸检测小鼠尿蛋白严重程度:±,5 mg/dL;+,30 mg/dL;++,100 mg/dL;+++,300 mg/dL;++++,

1 000 mg/dL[2]。根据尿蛋白严重程度将小鼠分为轻度LN(±~+)和重度LN(+++~++++)。

1.2.3 小鼠肾功能测定

小鼠8和28周龄时麻醉、杀灭后取血样。应用生化自动分析仪检测小鼠血肌酐及尿素氮。

1.2.4 小鼠血液dsDNA浓度测定

采用ELISA法测定小鼠dsDNA IgG浓度(美国Alpha Diagnostic International公司),按照说明书进行操作。

1.2.5 肾脏形态学观察

8周、28周和36周龄时处死小鼠后,立即留取肾脏皮质,2B多聚甲醛固定,常规石蜡包埋切片,进行HE、PAS、MASSON染色,光学显微镜下观察。

1.3 统计学分析

应用ssps 18.0软件进行数据处理,计量资料以x±s表示,组间比较采用t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 2组小鼠体质量比较

结果显示,小鼠体质量逐渐下降,在22周后趋于稳定。见表 1

表 1 2组小鼠体质量比较(g)
组别 8周 22周 28周
C57BL/6小鼠 25.758±2.167 27.231± 2.543 130.543±3.453
NZB/W F1小鼠 37.933±3.158 32.367 ±3.358 31.453±3.231

2.2 2组小鼠死亡情况

C57BL/6小鼠实验期间无死亡。NZB/W F1小鼠28周时死亡10只。其中,26号鼠2周内体质量下降超过20%且尿蛋白(++),处死小鼠(小鼠体质量下降过快是死亡信号,需及时留取活体标本);7号死鼠体质量未下降,解剖发现小鼠发生胸水(700 μL),1周前尿蛋白(++),考虑死因为胸水引起窒息;其他8只小鼠疾病自然病程加重死亡。

2.3 NZB/W F1小鼠LN鉴定

2.3.1 小鼠尿蛋白变化

结果显示,8、16、24、28周小鼠重度LN所占比例分别为0、10%、25%、40%。随着周龄增长,NZB/W F1小鼠出现重度LN概率增加。

2.3.2 小鼠肾功能变化

结果显示,随着周龄增加,NZB/W F1小鼠肾功能(血肌酐和血尿素氮)、dsDNA水平逐渐升高,28周与8周时比较,与同周龄C57BL/6小鼠比较均升高明显(均P < 0.05)。见表 2

表 2 小鼠血肌酐、尿素氮和dsDNA水平比较
组别 血肌酐(μmol/L) 尿素氮(μmol/L) dsDNA(U/mL)
8周龄NZB/W F1小鼠 38.23±0.13 7.51±0.13 1.46±0.15
28周龄NZB/W F1小鼠 129.21±0.281) 40.34±1.501) 2.35±0.121)
28周龄C57BL/6小鼠 33.82±0.15 7.29±0.23 1.35±0.14
1)与8周龄NZB/W F1小鼠及同龄C57BL/6小鼠比较,P < 0.05.

2.3.3 小鼠肾脏病理改变

结果显示,8周轻度LN NZB/W F1小鼠仅部分肾小球系膜增宽,细胞和基底膜基本正常,28周重度LN NZB/W F1小鼠肾小球系膜细胞增生明显,可见中性粒细胞浸润,基底膜增厚,伴有部分硬化,36周重度LN NZB/W F1小鼠肾小球增生更加明显,硬化也开始增加,有大量中性粒细胞浸润,基底膜僵硬,部分肾小管脱落坏死,36周龄C57BL/6小鼠基本没有变化,仅肾小球比28周重度LN NZB/W F1小鼠略增大,肾小球与36周重度LN NZB/W F1小鼠大小相同,见图 1

图 1 小鼠肾脏病理结果x400

3 讨论

NZB/W F1小鼠是新西兰黑鼠和新西兰白鼠之间的杂交子一代。杂交在3~4个月时形成高滴度自身抗体水平,产生免疫复合物介导的肾小球肾炎,类似于人类弥漫性增生性肾小球肾炎[3]

有研究[3]显示,80%小鼠在8个月时出现大量蛋白尿,90%在12月时死于肾功能不全,因此本研究只观察至小鼠28周(最多36周)。本研究中NZB/W F1小鼠在12周左右开始出现重度尿蛋白(+++),28周时重度尿蛋白(+++)发生率为40%。22周后小鼠的肾脏功能逐渐下降,病理改变在逐渐加重。研究[4]报道从3~4月起自身抗体滴度和肾功能指标逐渐升高,本研究显示小鼠28周时dsDNA和血肌酐已经明显高于8周龄NZB/W F1小鼠和同龄C57BL/6小鼠(P < 0.05)。NZB/W F1小鼠肾脏病理呈现典型的弥漫增生性肾小球肾炎,系膜细胞明显增生,大量中性粒细胞浸润,系膜基质增加,肾小球弥漫增生,甚至有部分硬化,部分区域基底膜僵硬,有局限性肾小管坏死。而C57BL/6小鼠在36周龄仍然没有任何病理改变。证明NZB/W F1小鼠LN模型建立成功。

SLE是多基因遗传疾病,是环境和遗传等多种因素作用的结果[5]。DNA降解、凋亡[6]、自噬[7]、细胞因子的异常[8]、T细胞和B细胞的异常[9-10]、激素水平异常[11]、基因和表观遗传学的关系[12]、基因和基因之间的相互作用[13]等在疾病的发生发展中起重要作用,但是具体病因仍不十分清楚,迫切需要典型动物模型来完成相应的研究课题。国际上大多应用新西兰小鼠回交造模研究遗传机制,但是由于价格昂贵国内很少报道。本研究LN模型成功建立证明NZB/W F1小鼠模型具备LN的典型症状,可以为LN发病机制和治疗研究提供重要依据。

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