水通道蛋白3 (aquaporin3, AQP3)属于水通道蛋白家族(aquaporins, AQPs), 是一种位于细胞膜上的蛋白质, 在细胞膜上组成"孔道", 可控制水、甘油和其他一些小溶质分子在细胞内外的进出^[1]。目前, AQP3被认为与癌症的发生发展密切相关^[2]。在肝癌中, 相对于癌旁组织, AQP3在肝癌组织中表达明显升高并且与肝癌的分级、分期、转移和预后有关^[3-5]。本研究中通过干扰沉默人肝癌细胞SMMC-7721的AQP3基因的表达, 检测其对细胞增殖和细胞凋亡的影响, 初步探讨AQP3与肝癌发生发展的关系, 可能为肝癌的诊断和治疗提供一个新的靶点和方向。

1 材料与方法 1.1 细胞培养

肝癌细胞株SMMC-7721购于中国科学院(中国上海)。DMEM培养基中加入10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和100 U/mL青霉素和链霉素(美国hyclone公司)。在37 ℃下、5% CO₂的加湿培养箱中培养细胞。

1.2 细胞转染

将SMMC-7721细胞接种在6孔板中, 并培养直至达60%融合。去除6孔板中含有的血清, 采用Lipofectamine 2000 (美国invitrogen公司)分别转染siRNA-NC、siRNA-AQP3#1和siRNA-AQP3#2 (苏州吉玛制药技术有限公司), 继续培养48 h后进行相关研究。将细胞分为4组:空白对照组、siRNA-NC组、siRNA-AQP3#1组和siRNA-AQP3#2组。siRNA-AQP3#1和siRNA-AQP3#2序列如下:siRNA-AQP3#1 F, 5'-CCUUUGCCAUGUGCUUCCUTT-3'; R, 5'-AGGAAGCACAUGGCAAAGGTT-3'。siRNA-AQP3#2 F, 5'-CCCUUAUCGUGUGUGUGCUTT-3'; R, 5'-AGCACACACACGAUAAGGGTT-3'。

1.3 RNA提取和qRT-PCR

参照Trizol说明书提取SMMC-7721总RNA。然后使用GoScript^TM Reverse Transcription Mix, Random Primers试剂盒(美国promega公司)反转录成cDNA。最后在ABI PRISMR 7500 (美国ABI公司) PCR仪上进行荧光实时定量PCR, cDNA扩增使用GoTaqR qPCR Master Mix (美国promega公司), 采用两步法标准PCR扩增程序:第1步(预变性) 95 ℃ 2 min 1个循环; 第2步(PCR反应) 95 ℃ 15 s, 60℃, 共40个循环。根据CT值通过公式2^-ΔΔCt进行相对定量分析计算得AQP3 mRNA相对表达量。AQP3的引物及内参β-actin^[10]由生工生物工程(中国上海)公司合成。AQP3 F, 5'-CCGTGACCTTTGCCATGTG-3'; R, 5'-CGAAGTGCCAGATTGCATCATAA-3'。β-actin F, 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3'; R, 5'-GTACGCCAACACAGTGCTG-3'。

1.4 细胞增殖实验

取对数生长期的细胞, 胰酶消化并收集4组细胞, 1 000 r/min离心, 去上清, 加入完全培养基, 调整细胞浓度到5×10³/mL, 接种于96孔板中, 每孔100 μL, 每孔设4个复孔, 分别培养24 h、48 h、72 h后, 每孔加入10 μL CCK8试剂(中国碧云天公司), 继续在培养箱孵育1.5 h, 在酶标仪上选择450 nm波长测定每孔的吸光度值, 描绘生长曲线。对于平板克隆实验, 将细胞以1 500/孔接种在6孔板上2周。然后, 用磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffer saline, PBS)洗涤细胞2次, 4%多聚甲醛固定, 0.5%结晶紫染色, 最后计数菌落数。

1.5 细胞凋亡检测

按照凋亡试剂盒(日本Dojindo labotories公司)说明书操作, 胰酶消化并收集4组细胞, PBS洗涤2次, 并收集约5×10⁵细胞, 1 000 r/min离心5 min后加入100 μL Annexin V缓冲液悬浮细胞, 最后分别加入PI和Annexin-V染液吹打混匀, 室温避光染色15 min加入400 μL Annexin V缓冲液, 流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.6 Western blotting

足量的4组细胞常规消化离心, 在冰上裂解, 将得到的裂解物离心, 取上清, 并用BCA法测定浓度, 样品均定量为5 μg/μL, 变性, 取50 μg蛋白经10% SDS-PAGE电泳, 70 V 80 min转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭90 min。孵育一抗(1:1 000), 4 ℃过夜孵育。次日, TBST洗膜后室温孵育二抗2 h (1:10 000), TBST清洗, 最后在ECL仪上完成发光。

1.7 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件分析, 数据用x±s表示, 2组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 干扰沉默后AQP3表达水平的检测

采用RNA干扰技术沉默AQP3基因, 实时PCR及Western blotting分析处理后的4组细胞的AQP3 mRNA及蛋白的表达水平。结果显示, siRNA-AQP3#1组(0.276 9±0.047 78)和siRNA-AQP3#2组(0.462 9±0.084 02)的AQP3 mRNA和蛋白质的表达明显下调(图 1), 且差异有统计学意义(P < 0.001, P < 0.01)。说明AQP3 siRNA转染可以有效的干扰沉默AQP3 mRNA和蛋白的表达。

2.2 CCK-8和平板克隆实验检测细胞增殖

使用CCK-8方法对4组细胞转染后24 h、48 h、72 h的活力进行观察, 发现siRNA-AQP3#1组(59.00±4.583)和siRNA-AQP3#2组(68.33±7.024)均表现出明显的活力降低, 说明细胞增殖能力减弱。平板克隆集落形成实验也得到相似的的结果(图 2), 且差异有统计学意义(P < 0.01, P < 0.05)。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

AnnexinV-FITC/PI双染法结果显示, siRNA-AQP3#1组(10.6±0.413 1)和siRNA-AQP3#2组(8.22±0.353 0)的凋亡比率明显高于其余2组(图 3), 且差异有统计学意义(P < 0.001, P < 0.01)。说明沉默AQP3能够明显促进SMMC-7721细胞的凋亡。

3 讨论

肝细胞癌是世界上第五大常见的癌症, 并且也是癌症相关死亡的第二大原因, 大多数患者在疾病的晚期被诊断出来, 失去手术治疗机会, 且预后较差^[6-7]。过去几十年, 人们一直致力于肝癌的分子机制研究, 而随着医学分子技术的发展, 众多关于肝癌发生发展的关键分子被发现及研究, 对于肝癌的诊断及治疗有着重大的意义。

AQPs是一类内在膜蛋白通道, 其促进水和小分子(如甘油)通过由渗透或溶质梯度驱动的细胞膜扩散。在哺乳动物中表达的13种同种型(AQP0~12)对水稳态和能量平衡起着至关重要的作用^[8-9]。AQP3基因位于人染色体9p13.3, 其在多种上皮细胞的基底外侧质膜中表达。在胃肠道中, AQP3在胃黏膜组织、回肠和远端结肠中表达, 有助于水和甘油的转运。在呼吸道中, AQP3在上呼吸道和下呼吸道中表达, 能够促进穿过气道上皮细胞的渗透水的运输。此外, AQP3在脑、乳腺、肝脏、胰腺、卵巢、前列腺和膀胱等上皮细胞中都有表达^[2]。近些年来, 随着先进的分子技术对AQPs研究的深入, 越来越多的研究证据表明, AQP3在癌症的进展和转移中起着关键作用。除了膀胱癌, AQP3在大多数癌症中都呈高表达, 具体的作用机制尚不清楚, 可能通过影响细胞增殖、迁移、上皮间质转化过程以及潜在的下游调控元件参与癌症的发生发展。例如, 在胰腺癌中, AQP3通过调节mTOR信号传导促进胰腺癌的增殖生长^[10]; 在胃癌中, AQP3参与细胞的增殖、迁移和侵袭过程, 并且可能通过调节PI3K/AKT/SNAIL信号通路参与胃癌细胞的上皮间质转化过程^[11]; 在乳腺癌中, AQP3通过调节H2O2转运及其下游细胞信号传导控制乳腺癌细胞的迁移过程^[12]。

本研究采用RNA干扰技术沉默人肝癌细胞SMMC-7721的AQP3表达, 沉默后的mRNA和蛋白水平明显下降, 说明AQP3 siRNA起到了很好的干扰效果。此外, 沉默AQP3引起的SMMC-7721细胞增殖能力减弱, 细胞凋亡增加, 但其具体作用机制尚不清楚。随着对AQP3在肿瘤发生发展过程中作用机制的深入研究, 相信AQP3未来将作为肝癌生物治疗的新靶点, 在肝癌的早期诊断、早期治疗中发挥更为重要的作用。