口腔舌鳞状细胞癌（以下简称鳞癌）是口腔颌面部一种常见的恶性肿瘤^[1]。由于表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）在口腔肿瘤的发生和进展中起重要作用，以EGFR为靶点的靶向药物如厄洛替尼和吉非替尼用于口腔癌的治疗^[2]。虽然取得了一定疗效，但治疗效果并不明显^[3]。获得性耐药是厄洛替尼治疗口腔癌效果不佳的重要原因，限制了其临床应用。因此，对厄洛替尼的耐药机制展开研究，探寻新的治疗方法，对于改善口腔癌患者的临床疗效具有重要意义^[4]。

近年来随着对葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）研究的不断深入，人们发现肿瘤细胞表面也存在GRP78的表达^[5]。细胞表面GRP78作为一种多功能蛋白质，对肿瘤细胞的生长、侵袭和转移等多种生物学特性具有调节作用^[6]。有文献^[7]报道，细胞表面GRP78通过激活MEK/ERK信号通路促进肿瘤细胞增殖，应用GRP78特异性抗体处理肿瘤细胞，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本课题组前期研究^[8]结果显示，GRP78在肝癌细胞表面过表达，促进肝癌细胞的侵袭。

本研究以厄洛替尼耐药性细胞TCA-8113-ER细胞为实验对象，检测GRP78在耐药性细胞表面的表达。并应用GRP78特异性抗体处理TCA-8113-ER细胞，观察抗体封闭对TCA-8113-ER细胞生长、侵袭和转移的影响，并探讨其是否可以增加TCA-8113-ER细胞对厄洛替尼的反应性，为提高厄洛替尼在口腔癌中的疗效提供新的线索。

1 材料与方法 1.1 材料

厄洛替尼耐药性舌鳞癌细胞TCA-8113-ER细胞由锦州医科大学附属第二医院口腔科黄克强教授惠赠，GRP78特异性抗体购于美国Santa Cruz公司。厄洛替尼购于美国Shelleck公司。c-MET、Akt、STAT3和磷酸化c-MET、Akt、STAT3抗体购于美国Cell Signaling公司。AV/PI试剂盒购于中国Biotools公司。Transwell培养板购于美国Corning公司。Matrigel胶购于美国BD公司。HRP标记二抗购自中山公司。Odyssey IRDye800二抗购自北京西美杰科技有限公司。ECL发光试剂购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养：TCA-8113细胞和TCA-8113-ER细胞培养在含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基中，37 ℃、5%CO₂环境下培养。2~3 d更换1次培养液。

1.2.2

MTT实验：将TCA-81130-ER细胞接种于96孔板中（5 000/孔），继续培养12 h使细胞完全贴壁。12 h后，分别加入终浓度为1、2、4、8 µg/mL的GRP78特异性抗体处理细胞48 h。48 h后取出培养板，每孔加入20 µL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养3~4 h。终止培养，弃去培养液，每孔加入150 µL DMSO溶解沉淀，于580 nm测定吸光度值，细胞活力值以处理组细胞吸光度值/对照组细胞吸光度值的百分数表示。为了检测GRP78特异性抗体对TCA-8113-ER细胞对厄洛替尼反应性的影响，GRP78特异性抗体（2 µg/mL）处理细胞24 h后，加入厄洛替尼（10 µmol/L）继续处理48 h，检测联合应用GRP78特异性抗体和厄洛替尼对TCA-8113-ER细胞活力的影响。实验分组：对照组（DMSO处理），厄洛替尼处理组，抗体处理组（GRP78特异性抗体处理），联合处理组（GRP78特异性抗体和厄洛替尼联合处理）。

1.2.3

克隆形成实验：将TCA-81130-ER细胞接种于6孔板中（5 000/孔），继续培养24 h，使细胞完全贴壁、伸展。每孔加入GRP78特异性抗体（2 µg/mL）处理细胞，每3 d更换1次培养液，重新加入GRP78特异性抗体（2 µg/mL）继续处理细胞。2周后终止培养，用0.1%的结晶紫对细胞进行染色，倒置显微镜观察细胞生长情况并拍照，并应用DMSO溶解结晶紫，于490 nm测定吸光度值。

1.2.4

Transwell实验：实验前应用Matrigel胶包裹上层小室聚碳酸酯膜（8 µmol/L）。将TCA-8113-ER细胞用无血清培养液悬浮接种于24孔Transwell培养板的上层小室内（10 000/孔），同时加入GRP78特异性抗体（2 µg/mL），下层小室内加入完全培养液。培养24 h后，取出上层小室，用酒精棉球擦拭上层小室内表面，上层小室外表面为迁移细胞。0.1%结晶紫染色，倒置显微镜下随机选取5个视野，计数每高倍视野上层小室外表面细胞数，以穿过细胞数代表细胞的侵袭能力。对照组用同型IgG处理。

1.2.5

创口愈合实验：将6孔板的底面应用10%纤黏连蛋白包被。待细胞融合成单层后，用灭菌的100 µL移液器头划痕，PBS漂洗3次，洗去悬浮细胞。加入1 mL含有2 µg/mL GRP78特异性抗体的无血清培养液，继续培养。24 h后取出培养板，倒置显微镜下观察创口愈合情况。对照组用同型IgG处理。

1.2.6

流式细胞术分析：将TCA-8113-ER细胞接种于6孔板中，待细胞密度达到90%时，对细胞进行处理。分为对照组（溶剂处理）、厄洛替尼处理组（采用厄洛替尼处理，终浓度10 µg/mL）、抗体处理组（GRP78特异性抗体，终浓度2 µg/mL）、联合处理组（GRP78特异性抗体处理24 h后，用厄洛替尼继续处理48 h，浓度同前）4组。AV/PI染色，流式细胞术分析细胞凋亡情况。

1.2.7

Western blotting：将GRP78特异性抗体处理的TCA-8113-ER细胞用RIPA缓冲液（1% NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、1% SDS、0.1% PMSF）裂解，BCA法定量，SDS-PAGE电泳，转膜，1%胎牛血清蛋白封闭，一抗（1:1 000稀释）4 ℃杂交过夜，PBST洗膜后加入HRP标记的二抗室温温育1 h，ECL显色。

1.2.8

in-cell western实验：将TCA-8113-ER细胞接种于96孔板，待细胞生长至90%左右用4%甲醛固定，5% BSA封闭1.5 h，一抗（1:200稀释）4 ℃杂交过夜，PBST清洗后加入Odyssey IRDye800二抗室温避光温育1 h，Odyssey近红外双荧光系统扫描。

1.3 统计学分析

采用SPPS 17.0软件进行统计分析，多组样品间的比较采用单因素方差分析，2组样品间的比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 GRP78特异性抗体抑制TCA-8113-ER细胞的生长

in-cell western实验结果（图 1A）显示，GRP78在厄洛替尼耐药性舌鳞癌细胞TCA-8113-ER细胞表面高水平表达。MTT实验结果显示，各浓度的GRP78特异性抗体均对TCA-8113-ER细胞的生长具有抑制作用，当抗体浓度达到2 µg/mL时明显抑制细胞生长（P < 0.05），继续增加抗体浓度，抑制作用增加不明显（资料未显示）。克隆形成实验结果（图 1B）显示，应用GRP78特异性抗体（2 µg/mL）处理细胞，可以明显抑制细胞生长，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 GRP78特异性抗体抑制TCA-8113-ER细胞的侵袭和转移

Transwell实验结果（图 2A）表明，对照组每低倍视野中细胞数约为20个，抗体处理组为73个，GRP78特异性抗体可以明显抑制TCA-8113-ER细胞的侵袭（P < 0.05）。创口愈合实验结果（图 2B）显示，对照组创口愈合率为34%，抗体处理组为63%，GRP78特异性抗体对TCA-8113-ER细胞的迁移具有抑制作用（P < 0.05）。

2.3 GRP78特异性抗体增强TCA-8113-ER细胞对厄洛替尼的反应性

MTT实验结果（图 3A）表明，与对照组相比，厄洛替尼处理组细胞活力为0.85，抗体处理组为0.68，联合处理组为0.39，与单独应用GRP78特异性抗体（2 µg/mL）或厄洛替尼相比，二者联合应用可以在短期内抑制TCA-8113-ER细胞的生长，差异有统计学意义（P < 0.05）。克隆形成实验结果（图 3B）显示，联合应用GRP78特异性抗体（2 µg/mL）和厄洛替尼（10 µmol/L）处理细胞，可以在一个较长时期内明显抑制TCA-8113-ER细胞生长，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.4 GRP78特异性抗体促进TCA-8113-ER细胞凋亡

流式细胞术分析结果（图 4）显示，与对照组相比，厄洛替尼处理组细胞凋亡率为15.1%，抗体处理组为21.3%，联合处理组为43.2%，与单独应用厄洛替尼和GRP78特异性抗体相比，二者联合应用可以明显促进细胞凋亡。

2.5 GRP78特异性抗体抑制c-MET、AKT和STAT3

Western blotting结果（图 5）显示，在GRP78特异性抗体处理的TCA-8113-ER细胞中，c-MET、p-c-MET、p-AKT和p-STAT3的表达水平明显低于未处理细胞，AKT和STAT3的表达变化不明显。

3 讨论

舌鳞癌细胞对EGFR抑制物抵抗，极大制约了以EGFR为靶点的治疗方法在临床上的应用。因此，增加舌鳞癌细胞对EGFR为靶点的治疗药物的反应性是一个急需解决的问题。

细胞表面GRP78可以发挥受体样作用，对细胞的增殖、侵袭、转移和耐药性形成等生物学特性发挥关键的调节作用，是肿瘤治疗的一个潜在靶点^[9]。研究^[10]显示应用抗体封闭细胞表面GRP78对肺癌、前列腺癌等肿瘤细胞增殖具有明显的抑制作用。本研究结果显示，GRP78在厄洛替尼耐药性舌鳞癌细胞表面高水平表达，这一结果提示细胞表面GRP78可能与舌鳞癌对EGFR抑制物的耐药性形成有关。本研究应用GRP78特异性抗体处理TCA-8113-ER细胞，发现抗体封闭可以明显抑制其增殖，增加其对厄洛替尼的反应性，这些结果提示GRP78特异性抗体对厄洛替尼耐药性舌鳞癌可能具有治疗作用。

本研究进一步观察了GRP78特异性抗体对TCA-8113-ER细胞侵袭和转移的影响，结果显示，GRP78特异性抗体处理可以抑制TCA-8113-ER细胞的侵袭和迁移，进一步证实了GRP78特异性抗体对厄洛替尼耐药性舌鳞癌具有治疗作用。

最后，本研究探讨了GRP78特异性抗体抑制厄洛替尼耐药性舌鳞癌细胞增殖、侵袭和转移的分子机制。许多研究^[11]证实c-MET在肿瘤的增殖、侵袭和转移过程中发挥关键的调节作用。本研究检测了GRP78特异性抗体是否抑制c-MET信号通路，结果发现GRP78特异性抗体明显抑制c-MET的磷酸化和表达，进一步研究发现GRP78特异性抗体可以抑制c-MET下游分子STAT3的磷酸化，而对其表达没有影响^[12]。

综上所述，抑制细胞表面GRP78可以抑制厄洛替尼耐药性舌鳞癌细胞的增殖、侵袭和转移，增强其对厄洛替尼的敏感性，为提高临床上以EGFR为靶点的治疗方案的疗效提供了新的线索。但本研究的实验结果局限于细胞水平，尚需在实验动物水平进一步进行验证。另外，本研究结果显示c-MET信号通路抑制与细胞对厄洛替尼的敏感性有关，但尚缺乏直接证据。以后的工作中将继续展开深入的研究，以期进一步证实细胞表面GRP78作为对EGFR抑制物耐药的舌鳞癌细胞的治疗价值和潜在的机制。