目前，乳腺癌发病率已跃居我国女性恶性肿瘤首位^[1]。乳腺癌发病受多种因素（遗传和环境因素等）影响。乳腺癌细胞具有异常增殖、分化程度低、侵袭能力强、转移发生早和细胞凋亡减少等特征，其中凋亡机制异常认为与乳腺癌的发生密切相关^[2]。SIAH1（seven in absentia homologue-1）含有环指结构，具有E3泛素连接酶活性，参与泛素化和蛋白酶体介导的特定蛋白质降解。传统观点认为SIAH1可介导包括自身在内的多种目标蛋白的泛素-蛋白酶体降解过程^[3]。近年来研究^[4-10]发现SIAH1亦与肿瘤细胞凋亡密切相关，但具体作用及机制尚不清楚。

S-亚硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）是机体内源性一氧化氮供体，高浓度GSNO会对机体产生毒性。GSNO使带有游离巯基的蛋白发生S-亚硝基化修饰。研究^[11]发现GSNO可以使细胞中甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）发生S-亚硝基化，S-亚硝基化的GAPDH可以和SIAH1结合，使SIAH1入核选择性地降解目标蛋白。

前期研究^[12]发现单纯性增生乳腺组织发展为浸润性癌的过程中，SIAH1蛋白在细胞质中表达逐渐降低，而在细胞核中表达逐渐升高，出现明显的核内蓄积趋势。同时前期研究^[13]表明细胞质内SIAH1可通过激活MAPK/JNK/c-jun通路促进Bim mRNA和蛋白表达，进而诱导乳腺癌细胞凋亡。本研究探讨乳腺癌中SIAH1蛋白细胞核-细胞质穿梭现象的原因，进一步观察SIAH1核异位后对乳腺癌细胞生物学行为的影响及其作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料

收集浙江省舟山医院病理科2014年至2015年40例原发性乳腺浸润性导管癌手术切除石蜡标本，患者年龄为33~76岁（中位年龄49岁），所有患者术前均未接受放化疗，所有病理资料均由2名高级职称病理医师联合诊断。本研究及所有标本使用经舟山医院伦理委员会批准，并获得患者知情同意。

主要试剂包括S-P免疫组织化学检测试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒（DAB-0031）（中国福州迈新生物技术公司）；鼠抗人SIAH1抗体（美国Santa Cruz公司），兔抗人Bim抗体（美国Santa Cruz公司），β-actin抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；SIAH1 siRNA（美国Santa Cruz公司）；DMEM培养液、胎牛血清（美国GIBCO公司）；Lipofectamine 2000、核蛋白提取试剂盒（美国Invitrogen公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色及结果判定

标本经4%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm切片，按照S-P免疫组织化学检测试剂盒说明书步骤进行SIAH1（1:200）免疫组织化学染色。SIAH1核异位表达判定标准：以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性显色。

1.2.2 细胞培养及SIAH1核异位表达乳腺癌细胞模型的构建

用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO₂环境下培养乳腺癌细胞系MCF-7。随后在MCF-7细胞中加入100 mmol/L GSNO培养24 h后收集细胞。

1.2.3 RNA干扰

干扰片段为SIAH1 siRNA、control siRNA和E2F1 siRNA，按照脂质体Lipofectamine 2000试剂说明书进行操作、转染，培养48 h后收集细胞。

1.2.4 Western blotting检测

按照相应蛋白提取试剂盒说明书分别提取核蛋白及总蛋白，测定蛋白浓度，样品和上样缓冲液以4:1混合，SDS-PAGE电泳后，转至PVDF膜，脱脂奶粉封闭，加入一抗山羊抗人SIAH1（1:400），兔抗人Bim（1:400），抗β-actin（1:200）和兔抗人LaminB1（1:400），4 ℃孵育过夜；Ⅱ抗（酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，上海基因科技股份有限公司）孵育2 h，TBST洗脱3次，发光显影；应用Image J软件进行蛋白条带灰度分析。实验至少重复3次，计算平均值。

1.2.5 免疫荧光及共聚焦实验

乳腺癌细胞系MCF-7细胞中加入100 mmol/L GSNO培养24 h后，将细胞接种到预先放置处理过盖玻片的培养皿中，细胞长成单层后取出盖玻片，PBS洗2次；甲醇固定20 min，PBS洗3次，每次5 min；1%Triton通透30 min，PBS洗3次，每次5 min；封闭30 min；一抗室温孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；50 μg/mL FITC室温避光孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min；蒸馏水漂洗1次，DAPI（1:200）染色细胞核；滴加封片剂封片，在共聚焦荧光显微镜下观察。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

收集细胞，加入300 μL 1×binding buffer悬浮细胞，加入Annexin V-FITC（5 μL）混匀后进行Annexin V-FITC标记，加入PI（5 μL）染色，最后进行流式细胞仪分析。

1.2.7 GSNO合成

取4 mL GSH，加2 mL HCl酸化，加入4 mL NaNO₂，混合冰浴反应20 min，加入40% NaOH调整pH至7.0左右，避光保存。产物稀释200倍，PBS为阴性对照，酶标仪测定334 nm处吸光度。计算GSNO浓度，利用PBS调整终浓度为100 mmol/L。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计数资料采用χ²检验，并计算Spearman等级相关系数，计量资料比较采用t检验或方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 乳腺癌中存在SIAH1核异位表达蓄积现象

前期研究^[12]发现，SIAH1在正常乳腺组织中细胞质高表达，而细胞核阴性表达。在乳腺癌癌变过程中细胞质内SIAH1蛋白表达逐渐下调，且与乳腺临床病理因素（临床分期、分化）显著相关。本研究结果显示，部分患者乳腺癌组织中（12/40）乳腺癌细胞核内检测出SIAH1阳性信号，SIAH1核表达在乳腺癌组织中高于对应的癌旁正常组织（图 1）。

2.2 GSNO诱导SIAH1核异位表达的乳腺癌细胞系构建

为进一步研究SIAH1核异位表达对细胞功能的影响，本研究构建了GSNO诱导的SIAH1核异位表达的乳腺癌细胞系模型。激光共聚焦方法检测结果显示，乳腺癌MCF-7细胞中SIAH1主要在细胞质内低表达；给予100 mmol/L GSNO刺激后SIAH1在细胞核内表达增加（图 2）。Western blotting检测结果表明，与对照组（0.31±0.01）比较，加入50 mmol/L和100 mmol/L GSNO刺激后，SIAH1核蛋白表达（分别为1.21±0.20，1.85±0.35）明显增加（均P < 0.05）。

2.3 SIAH1核异位表达抑制细胞凋亡

流式细胞仪检测乳腺癌细胞凋亡结果显示，与对照组（11.02%±1.310%）比较，加入100 mmol/L GSNO的实验组可明显抑制乳腺癌细胞凋亡（24 h：2.02%±0.310%；48 h：1.06%±0.091%），差异均有统计学意义（F分别为110.317、130.113，P分别为0.038、0.041），见图 3。

在乳腺癌MCF-7细胞系中应用siRNA片段干扰SIAH1的表达，与对照组比较，SIAH1siRNA组SIAH1的核蛋白表达缺失，见图 4。在MCF-7-SIAH1SiRNA细胞中应用100 mmol/L GSNO处理24 h及48 h，流式细胞仪检测凋亡率结果显示，GSNO处理组在24 h及48 h后细胞凋亡率分别为0.83%±0.338%、0.72%±0.653%，与对照组（1.05%±0.910%）比较无统计学差异（均P > 0.05），见图 5。

2.4 GSNO诱导SIAH1核转位后E2F1/Bim的表达下降

Western blotting检测结果表明，在MCF-7细胞中应用100 mmol/L GSNO刺激后，与对照组比较，SIAH1核蛋白表达增加，而E2F1和Bim蛋白表达均降低。在MCF-7细胞GSNO刺激的同时siRNA干扰E2F1结果发现，与对照组比较E2F1和Bim蛋白表达均下降（图 6）。

凋亡结果显示，与未处理组比较（10.32%±1.110%），MCF-7细胞GSNO刺激同时siRNA干扰E2F1组细胞凋亡率（0.82%±0.021%）明显下降，差异有统计学意义（F = 131.063，P < 0.05），见图 7。

3 讨论

YOSHIBAYAS等^[14]研究发现，SIAH1可通过依赖β-catenin降解和不依赖β-catenin降解2条途径共同促进肝癌细胞凋亡。HE等^[15]研究表明SIAH1可通过增强放射线敏感度促进乳腺癌细胞凋亡。而KUROKAWA等^[16]发现SIAH1可以降低促凋亡蛋白HIPK2稳定性，提示其可能发挥抑制细胞凋亡作用。前期研究^[12]提示SIAH1作为肿瘤抑制因子在乳腺癌癌变过程中发挥重要作用。

本研究证实SIAH1在部分乳腺癌组织中存在核表达，提示乳腺癌中存在SIAH1核异位表达蓄积现象。有研究^[11]发现SIAH1具有GSNO依赖的核异位表达现象。本研究显示GSNO可以诱导乳腺癌细胞中SIAH1入核，抑制SIAH1表达后这种作用消失。流式细胞仪检测结果表明GSNO可以抑制乳腺癌细胞凋亡，且这一过程与SIAH1核转位有关。因此，进一步研究SIAH1核转位抑制乳腺癌细胞凋亡的分子机制，对深入了解SIAH1生物学功能具有重要的意义。

研究^[17]表明转录因子E2F1是细胞增殖和凋亡的关键调节因子，且在肺癌细胞系中E2F1可介导SIAH1的调控机制，本研究结果显示给予乳腺癌细胞GSNO刺激后，细胞核SIAH1蛋白表达增加，而E2F1和Bim蛋白表达均降低，提示GNSO诱导SIAH1核异位后可能降低E2F1和Bim蛋白表达。为进一步研究E2F1/Bim在SIAH1核转位中对细胞凋亡的影响，给予乳腺癌细胞GSNO刺激的同时siRNA干扰E2F1的表达，流式细胞仪检测结果表明处理后的细胞早期凋亡率明显下降，提示GNSO诱导SIAH核异位后抑制乳腺癌细胞凋亡可能是通过下调E2F1来调控的。

综上所述，乳腺癌组织中可出现SIAH1核异位现象。在乳腺癌细胞系中，GNSO诱导SIAH1核异位后可能是通过下调E2F1的表达抑制乳腺癌细胞凋亡，提示SIAH1可能成为乳腺癌治疗的潜在靶点。E2F1/Bim是如何在GSNO诱导的SIAH1核异位表达中发挥作用，具体机制有待于今后进一步探讨。