喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一, 以鳞状细胞癌为主^[1]。虽然治疗手段不断进步, 但是喉癌患者的总生存率仍未提高^[2], 侵袭转移是喉癌的主要死因^[3]。因此, 研究喉癌发生发展的分子机制有助于发现喉癌诊治和预后判定的分子标志物, 具有重要的潜在临床意义。微小RNA (microRNA, miRNA)是一种内源性非编码小RNA, 参与多种肿瘤的发生发展, 因其在人体多种体液中稳定表达可望成为多种疾病的分子标志物^[4]。前期工作^[5]表明, miR-362-3p是MYCT1基因的下游调控基因。miR-362-3p在肾细胞癌^[6]、乳腺癌^[7]、血管平滑肌细胞^[8]、滋养层细胞^[9]和胃癌细胞^[10]的迁移和侵袭中发挥重要作用。然而, miR-362-3p在喉癌中的作用和机制研究未见报道。本研究拟通过分子生物学技术检测miR-362-3p在喉癌组织中表达水平及其对喉癌细胞迁移能力的影响, 为进一步研究miR-362-3p在喉癌中的作用和分子机制提供线索。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 标本收集

50例喉癌及癌旁正常组织标本取自解放军第463医院耳鼻喉科, 手术后立即置于-80℃深冻冰箱中保存备用, 其中, 42例标本具有完整临床资料信息, 所有患者均知情同意并签署知情同意书。术后标本均经病理学检查确诊, 本项目研究经中国医科大学伦理委员会批准。

1.1.2 细胞株

人喉癌Hep-2细胞购自中科院上海细胞所。

1.1.3 试剂

Trizol试剂、miRNA逆转录试剂盒、实时PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司, Poly plus转染试剂购自法国Afao公司, 8.0 μm孔径Transwell小室购自美国Coster公司。

1.2 方法

1.2.1 实时PCR检测

应用Trizol试剂提取细胞和组织总RNA, 应用miRNA反转录试剂盒反转miRNA为cDNA, 反转录条件为37℃ 60 min, 85℃ 5 min。以U6作为内参, 应用实时PCR检测miR-362-3p表达水平。miR-362-3p模拟物、抑制剂和阴性对照microRNA由武汉金开瑞生物工程公司合成, 主要引物序列:U6, F, 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3';R, 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。miR-362-3p, 5'-AACACACCTATTCAAGATTCA-3'。通用下游引物, 5'-CGAATTCTAGAGCTCGAGGCAGGCGACATGGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCC (T)25VN-3。

1.2.2 细胞转染

喉癌Hep-2细胞以2.5×10⁵/孔密度种于6孔板中, 培养过夜至细胞汇合度约为70%。根据Poly plus转染试剂说明书操作, 将miR-362-3p模拟物、抑制剂和阴性对照microRNA转染Hep-2细胞, 4~6 h后更换培养基。48 h后提取细胞RNA, 应用实时PCR检测miR-362-3p表达水平。

1.2.3 细胞划痕愈合实验

应用200 µL枪头在转染后的6孔板各孔直径处划过, 显微镜下观察并拍照。继续培养细胞, 分别在24 h、48 h显微镜下测量迁移距离并拍照, 统计分析细胞迁移距离。

1.2.4 Transwell迁移小室实验

0.25%胰酶消化转染后的细胞, 收集细胞沉淀并用双无培养基重悬细胞。在上层小室中加入2×10⁴个细胞, 下室加入600 µL正常培养基。培养24 h后, 依次用4%多聚甲醛固定, 苏木素染色1 min、伊红染色2 min、苏木素复染1 min, 用刀片切下膜, 中性树胶封片。显微镜下随机选取5个视野计数细胞并拍照, 5个视野平均数作为每个小室的细胞数。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析, 数据以x±s表示, 组间比较采用t检验或单因素方差分析, P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 miR-362-3p在喉癌中表达水平的检测结果

以U6为对照, 应用实时PCR检测50例喉癌和癌旁正常组织中miR-362-3p表达水平, 结果表明, 66%(33/50)喉癌组织中miR-362-3p表达水平(8.84±21.42)较癌旁正常组织(1.76±3.03)升高, 差异具有统计学意义(t=2.316, P=0.025)。

2.2 miR-362-3p在喉癌组织中表达水平与临床病理特征的关系

结果表明, miR-362-3p与淋巴结转移和喉癌临床分期密切相关(均P < 0.05), 而与患者性别、年龄、分化等因素不相关(均P > 0.05), 见表 1。

2.3 miR-362-3p对喉癌Hep-2细胞迁移能力的影响

实时PCR结果显示, miR-362-3p模拟物组(73.33±48.39)和抑制物组(0.38±0.11)与阴性对照microRNA组(NC组, 1.00±0.00)比较, 喉癌Hep-2细胞中miR-362-3p表达水平分别显著升高和降低(均P < 0.05), 提示转染成功。划痕愈合实验结果显示, miR-362-3p模拟物组细胞迁移距离显著大于NC组, 而miR-362-3p抑制剂组迁移距离显著小于NC组(均P < 0.05), 见表 2、图 1A; Transwell实验结果显示, miR-362-3p模拟物组迁移细胞数量显著高于NC组, 而miR-362-3p抑制剂组迁移细胞数目显著少于NC组(均P < 0.05), 见表 2、图 1B。

3 讨论

miR-362是重要微小非编码RNA, 在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。miR-362在不同肿瘤中作用不同, 提示其具有组织特异性。miR-362-3p在肾癌和乳腺癌中发挥抑癌基因作用^[6-7], 而在胃癌和肝癌中发挥癌基因作用^[10-12]。

本研究发现miR-362-3p在喉癌组织中高表达, 临床病理特征分析结果显示miR-362-3p在喉癌组织中的表达水平与淋巴结转移和临床分期有关。同时, miR-362-3p促进喉癌细胞迁移, 提示其在喉癌中发挥潜在癌基因作用。与本研究结果相似, 以往研究^[10-13]表明miR-362-3p在胃癌、肝癌和结肠癌中高表达, 促进胃癌细胞的迁移。而与本研究结果相反, 以往研究^[6-7]表明, miR-362-3p在肾癌和乳腺癌中低表达并抑制肾癌和乳腺癌细胞的迁移。除肿瘤外, 低氧条件下miR-362-3p抑制滋养层细胞的侵袭和转移^[9]; miR-362-3p在冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血液中低表达, 并抑制血管平滑肌细胞迁移^[8]。

众所周知, miRNA通过抑制或降解靶基因mRNA发挥生物学功能。miR-362-3p通过靶向CD82促进胃癌细胞上皮间质转化^[10]。在肾细胞癌中miR-362-3p表达下调并靶向nemo样激酶抑制肿瘤细胞侵袭^{[6, 14]}。在其他疾病中miR-362-3p通过靶向ADAMTS1抑制血管平滑肌细胞的迁移^[8]; miR-362-3p靶向Pax3抑制滋养层细胞的增殖、迁移和侵袭^[9]。然而, miR-362-3p通过哪些靶基因促进喉癌细胞的迁移作用需进一步研究证实。

综上所述, miR-362-3p在喉癌组织中表达上调, 促进喉癌细胞迁移, 提示其在喉癌发生中发挥潜在癌基因作用, 本研究为进一步探讨miR-362-3p表达在喉癌细胞迁移的分子机制提供了重要线索。