2019, Vol. 48
CNOT7基因敲减通过减少HepG2细胞TGF-β1分泌影响免疫微环境
文章信息
- 郭舜, 赵海潮, 任晓静, 任崇仁, 贺杰峰, 赵浩亮
- GUO Shun, ZHAO Haichao, REN Xiaojing, REN Chongren, HE Jiefeng, ZHAO Haoliang
- CNOT7基因敲减通过减少HepG2细胞TGF-β1分泌影响免疫微环境
- Effect of CNOT7 Gene Knockdown on the Immune Microenvironment of HepG2 Cells by Reduced TGF-β1 Secretion
- 中国医科大学学报, 2019, 48(3): 225-229
- Journal of China Medical University, 2019, 48(3): 225-229
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文章历史
- 收稿日期：2018-10-22
- 网络出版时间：2019-2-28 10:37
引用本文 |
郭舜, 赵海潮, 任晓静, 任崇仁, 贺杰峰, 赵浩亮.
CNOT7基因敲减通过减少HepG2细胞TGF-β1分泌影响免疫微环境[J]. 中国医科大学学报, 2019, 48(3): 225-229.
GUO Shun, ZHAO Haichao, REN Xiaojing, REN Chongren, HE Jiefeng, ZHAO Haoliang. Effect of CNOT7 Gene Knockdown on the Immune Microenvironment of HepG2 Cells by Reduced TGF-β1 Secretion[J]. Journal of China Medical University, 2019, 48(3): 225-229.
CNOT7基因敲减通过减少HepG2细胞TGF-β1分泌影响免疫微环境
1. 山西医科大学研究生院, 太原 030001;
2. 山西医科大学附属大医院普通外科, 太原 030001
2. 山西医科大学附属大医院普通外科, 太原 030001
摘要：目的 研究人CCR4-NOT转录复合体亚基7（CNOT7）基因敲减对肝母细胞瘤细胞系HepG2免疫微环境的影响并探讨其意义。方法 设计细胞转染方案，将实验分为3组：靶向敲减CNOT7组、阴性对照组和过表达CNOT7组，获得各组细胞后，用倒置荧光显微镜观察细胞转染效率。Western blotting方法检测CNOT7、转化生长因子-β1（TGF-β1）及核转录因子-κB（NF-κB）p65蛋白的表达水平，ELISA法测定细胞培养上清液中TGF-β1水平。流式细胞术检测转染后肿瘤细胞对自然杀伤（NK）细胞杀伤功能的敏感性。结果 与阴性对照组相比，靶向敲减CNOT7组TGF-β1和NF-κB p65蛋白表达水平显著降低，过表达CNOT7组TGF-β1和NF-κB p65蛋白表达水平显著升高；靶向敲减CNOT7组细胞培养上清液中TGF-β1水平显著降低，过表达CNOT7组TGF-β1水平显著升高；NK细胞与肿瘤细胞共培养，靶向敲减CNOT7组细胞凋亡率显著升高，过表达CNOT7组细胞凋亡率显著降低。结论 CNOT7基因参与肝细胞癌免疫微环境的形成，靶向敲减CNOT7基因可减少TGF-β1分泌，增强NK细胞对肝癌细胞的杀伤功能。
Effect of CNOT7 Gene Knockdown on the Immune Microenvironment of HepG2 Cells by Reduced TGF-β1 Secretion
1. Graduate School, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;
2. Department of General Surgery, Shanxi Dayi Hospital Affiliated to Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
2. Department of General Surgery, Shanxi Dayi Hospital Affiliated to Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
Abstract: Objective To study the effect of human CCR4-NOT transcription complex subunit 7 (CNOT7) gene knockdown on the immune microenvironment of HepG2 cells and explore its significance. Methods We designed a cell transfection protocol and performed the experiment with three groups:CNOT7-targeted knockdown group, control group, and CNOT7 overexpression group. The transfection efficiency was assessed using inverted fluorescence microscopy, and the expression level of CNOT7, transforming growth factor-β1 (TGF-β1), and nuclear factor-kappa B (NF-κB) p65 proteins was determined by western blotting. The concentration of TGF-β1 secreted in the cell culture supernatant was measured by ELISA. The sensitivity of tumor cells to the killing function of natural killer (NK) cells was detected by flow cytometry. Results Compared with the control group, the expression level of TGF-β1 and NF-κB p65 proteins was significantly decreased in the CNOT7-targeted knockdown group, and the TGF-β1 concentration in the culture supernatant was also significantly reduced. However, in the CNOT7 overexpression group, the expression level of the two proteins and TGF-β1 concentration were significantly increased. NK cells were co-cultured with tumor cells, and the apoptosis rate of HepG2 cells transfected with CNOT7-specific shRNA was significantly increased. However, in the CNOT7 overexpression group, the apoptosis rate was significantly decreased. Conclusion CNOT7 forms the immune microenvironment of hepatocellular carcinoma. Targeted knockdown of CNOT7 can reduce TGF-β1 secretion and enhance the killing function of NK cells toward HepG2 cells.
Keywords:
hepatocellular carcinoma immunomicroenvironment transforming growth factor-β1 CCR4-NOT transcription complex subunit 7
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是人类常见的恶性肿瘤之一。我国是HCC高发国家, HCC占全球病例总数和死亡人数的50%左右[1]。目前HCC的治疗模式已从单一学科治疗发展为多学科综合治疗, 其中HCC的免疫治疗已成为国内外研究的热点[2-3]。CCR4-NOT转录复合体亚基7(CCR4-NOT transcription complex subunit 7, CNOT7)是真核生物CCR4-NOT蛋白复合体的重要亚基之一[4], 参与调控多种肿瘤微环境相关蛋白的转录[5]。本课题组前期通过蛋白组学筛查, 发现其在肝癌组织中显著高表达[6]。作为免疫特惠器官, 肝脏具有独特的免疫系统, 并参与机体局部及整体水平的免疫调节。HCC免疫微环境中富含调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)、未成熟树突状细胞等免疫抑制细胞及转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)等免疫抑制因子。这种免疫抑制的微环境也成为HCC容易形成免疫逃逸的重要原因之一[7]。其中, TGF-β1作为一种多效性细胞因子, 是目前发现的肿瘤诱导产生的免疫抑制因子之一, 在HCC的免疫调节中发挥重要功能[8-9]。HCC患者体内TGF-β1水平越高, 其预后越差, 并与预后不良密切相关[8-9]。自然杀伤(natural killer, NK)细胞是固有免疫应答的参与者, 有调查结果显示肝癌患者组织中NK细胞的数量与患者生存期长短密切相关, 但是在临床研究中, 将体外扩增的NK细胞进行回输, 治疗效果并不理想, 这可能与肝癌免疫微环境有关[10]。本研究旨在探讨CNOT7基因敲减对HepG2细胞分泌TGF-β1的影响及其在HCC免疫微环境中的作用, 为HCC的免疫治疗提供一些新的思路。
1 材料与方法 1.1 主要材料及试剂HepG2细胞和NK细胞, 购自中科院细胞库; Lipofectamine 3000、opti-MEM培养基、人TGF-β1 ELISA试剂盒, 购自武汉博士德公司; 阴性对照质粒、CNOT7敲减质粒和CNOT7过表达质粒均购自上海吉凯基因生物化学技术有限公司。
1.2 HepG2细胞的培养与转染HepG2细胞培养于添加10%胎牛血清和青链霉素双抗的DMEM培养基, 于5% CO2和37℃的恒温密闭细胞培养箱中培养。规律传代3~4 d至细胞对数生长期, 按1×106/孔接种于6孔板上, 孵育12~15 h后, 使用Lipofectamine 3000进行转染。根据Lipofectamine 3000说明书将实验分为3组:阴性对照组、靶向敲减CNOT7组和过表达CNOT7组, 各组设有复孔。转染后放入37℃、5% CO2孵箱中培养6 h后, 分别更换为含10%胎牛血清的培养基。转染后48 h, 收集细胞进行转染分析, 倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率。采用Western blotting检测3组细胞CNOT7蛋白、TGF-β1蛋白和核转录因子-κB (nuclear factor kappa B, NF-κB) p65蛋白的表达。采用ELISA法测定细胞培养上清液中TGF-β1水平。
1.3 Western blotting收集转染48 h后的各组细胞, 用0.25%的胰蛋白酶将细胞消化并离心收集后用预冷PBS洗涤2次, 溶解在含有PMSF和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中。BCA法测定蛋白浓度。每组取等量蛋白10 μg与上样缓冲液混合后, 常规行SDS-PAGE凝胶电泳, 取目的条带转膜处理, 用5%牛血清白蛋白封闭后, 分别加入1:500稀释的CNOT 7一抗、1:1 000稀释的TGF-β1一抗、1:400稀释的NF-κB p65一抗以及1:1 000稀释的β-actin一抗4℃孵育过夜。次日加入1:2 000稀释的二抗, 室温孵育1 h, TBS洗膜后用ECL检测试剂盒进行信号检测。以β-actin蛋白作为内参照, 用ImageJ软件测量蛋白条带光密度值, 最终结果表示为目的条带与内参β-actin的比值。
1.4 ELISA实验取各组细胞培养上清液, 按照试剂盒说明, 检测上清液中TGF-β1表达水平。
1.5 细胞凋亡实验将转染后3组细胞按1×106/孔接种于6孔板上, 孵育过夜。NK细胞采用CD3+包被刺激24 h活化。活化的NK细胞分别与3组细胞共培养。CSFE标记肿瘤细胞, 7-AAD标记发生凋亡的肿瘤细胞。6 h后, 流式细胞术检测肿瘤细胞对NK细胞杀伤功能的敏感性。
1.6 统计学分析采用SPSS 24.0软件进行数据分析。数据均以x±s表示, 组间比较采用t检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 HepG2细胞转染效率分析对HepG2细胞进行转染, 通过倒置荧光显微镜观察细胞转染效率(图 1), 各组细胞均发出明亮绿色荧光。采用Western blotting分析转染效率(图 2)。与阴性对照组相比, 靶向敲减CNOT7组CNOT7蛋白表达水平降低(t=7.975, P < 0.05), 过表达CNOT7组CNOT7蛋白表达水平升高(t=8.017, P < 0.05), 差异均有统计学意义。
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| A, CNOT7-targeted knockdown group; B, control group; C, CNOT7 overexpression group. 图 1 倒置荧光显微镜下细胞荧光图像 ×200 Fig.1 Fluorescence microscopy images of cells ×200 |
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| A, CNOT7 expression; B, relative expression level of CNOT7.1, control group; 2, CNOT7-targeted knockdown group; 3, CNOT7 overexpression group. *P < 0.05 vs control group. 图 2 细胞转染后HepG2细胞中CNOT7蛋白的表达 Fig.2 Expression of CNOT7 in HepG2 cells after transfection |
2.2 HepG2细胞中CNOT7对TGF-β1和NF-κb p65蛋白表达水平的影响
通过Western blotting分析细胞转染后HepG2细胞中TGF-β1和NF-κB p65蛋白表达变化(图 3)。结果显示, 与阴性对照组相比, 靶向敲减CNOT7组TGF-β1(t=7.374, P < 0.05)和NF-κB p65蛋白(t=4.436, P < 0.05)表达水平显著降低, 过表达CNOT7组TGF-β1(t=18.56, P < 0.05)和NF-κB p65蛋白(t=4.729, P < 0.05)表达水平显著升高, 差异均有统计学意义。
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| A, TGF-β1 and NF-κB p65 expression levels; B, relative expression level of TGF-β1;C, relative expression level of NF-κB p65.1, control group; 2, CNOT7-targeted knockdown group; 3, CNOT7 overexpression group.*P < 0.05 vs control group. 图 3 细胞转染后HepG2细胞中TGF-β1和NF-κb p65蛋白的表达 Fig.3 Expression of TGF-β1 and NF-κB p65 in HepG2 cells after transfection |
2.3 CNOT7对培养上清液中TGF-β1水平的影响
ELISA结果显示, 与阴性对照组相比, 靶向敲减CNOT7组细胞培养上清液中TGF-β1水平显著降低(t=15.136, P < 0.05), 过表达CNOT7组TGF-β1水平显著升高(t=10.514, P < 0.05), 差异均有统计学意义。见图 4。
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| 1, control group; 2, CNOT7-targeted knockdown group; 3, CNOT7 overexpression group.*P < 0.05 vs control group. 图 4 培养上清液TGF-β1浓度 Fig.4 TGF-β1 concentration in culture supernatant |
2.4 NK细胞对HepG2细胞杀伤能力的变化
流式细胞仪检测NK细胞对转染后2组细胞的杀伤能力。由图 5可见, NK细胞与转染后的HepG2细胞共培养后, 靶向敲减CNOT7组凋亡细胞比例为29.7%, 较阴性对照组14.5%显著升高, 过表达CNOT7组凋亡细胞比例为5.7%, 较阴性对照组显著降低, 差异均有统计学意义(P < 0.05)。
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| A, control group; B, CNOT7-targeted knockdown group; C, CNOT7 overexpression group. 图 5 细胞转染后NK细胞对HepG2细胞杀伤能力的变化 Fig.5 Changes in the killing ability of NK cells toward HepG2 cells after transfection |
3 讨论
TGF-β1可有多种来源, 在HCC组织中主要由Treg细胞分泌和肿瘤细胞自身分泌。肿瘤微环境中Treg细胞的增加, 很可能主要依赖于肿瘤来源的TGF-β1[11]。肿瘤细胞分泌的TGF-β1可抑制CD8+、NK细胞的杀伤功能, 并将初始的CD4+T细胞诱导成Treg细胞; 导致肿瘤细胞周围Treg细胞富集, 分泌更多TGF-β1, 形成肿瘤局部免疫抑制的微环境[12]。研究表明, TGF-β1在细胞免疫和细胞凋亡过程中起重要作用。在肿瘤发展早期, TGF-β1对肿瘤细胞起抑制作用, 但是当肿瘤细胞对其抑制作用产生抵抗时, TGF-β1反而会促进肿瘤进展, 从而诱导肿瘤细胞迁移和侵袭, 介导免疫抑制和肿瘤局部免疫微环境的改变, 促进肿瘤细胞存活[13]。因此, 探索肿瘤细胞高分泌TGF-β1的机制并通过靶向抑制其分泌, 将有助于改善肿瘤的免疫微环境。
本研究发现CNOT7基因在HepG2细胞系中能够正向调控TGF-β1和NF-κb p65蛋白表达水平, 提示CNOT7可能通过NF-κb p65通路调控TGF-β1表达水平。此外, 本研究还发现, 敲减CNOT7后HepG2细胞外分泌的TGF-β1水平显著降低。与此同时, 与阴性对照组相比, CNOT7基因敲减后, HepG2细胞对NK细胞杀伤力的敏感性显著增加。这提示CNOT7基因表达下调部分逆转HepG2细胞对NK细胞的免疫耐受。通过检测细胞转染后NF-κB p65蛋白的变化, 发现CNOT7在HepG2细胞系中显著促进NF-κB p65蛋白表达水平, 提示CNOT7能够通过NF-κB p65调控TGF-β1表达水平。
综上所述, 本研究结果表明:CNOT7基因可能通过NF-κB信号通路调控TGF-β1的分泌水平参与了HCC免疫微环境的调节, 同时CNOT7基因表达下调增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。CNOT7基因敲减改善HCC的免疫微环境, 这可能为后续研究HCC免疫治疗提供新的靶点。
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