神经系统的基本组织是神经组织，神经组织由神经元和神经胶质组成。神经胶质主要包括星形胶质细胞、施万细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞等。星形胶质细胞是中枢神经系统内数量最多的胶质细胞，在损伤、感染、缺氧、缺血或神经退行性疾病等病理条件下，星形胶质细胞可以发生活化反应，进而迅速增殖，最终形成胶质瘢痕。而且，损伤诱导的胶质细胞活化可直接或间接引起神经元死亡或修复。血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）与配体发生特异性结合后使受体二聚化暴露活性位点，从而激发酪氨酸激酶的活性，激活受体的自体磷酸化^[1]和酪氨酸激酶活化。已有研究^[2-3]指出，多种细胞包括巨噬细胞、成纤维细胞、周细胞、血管内皮细胞，都表达PDGFR。DEUEL等^[4]也报道，巨噬细胞来源的PDGFR在炎症和损伤修复时诱导单核细胞和成纤维细胞的趋化和增殖。据文献^[5]报道，在肾脏纤维化中磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）的p85亚单位通过SH2结构域与磷酸化的PDGFR结合，再激活下游分子丝氨酸/苏氨酸激酶（serine threonine protein kinase，Akt）如蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），后者使核蛋白体上丝氨酸残基磷酸化，促进DNA的合成，促使肌动蛋白重组，介导代谢调节，刺激细胞生长并阻止细胞凋亡。

因此，本研究向体外培养的小鼠脑星形胶质细胞中加入血小板衍生生长因子BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB），观察对细胞的影响，并观察给予PDGFR的小分子抑制剂AG1296后的变化，以验证PDGFR/PI3K/Akt通路对星形胶质细胞活化的影响，为探究胶质细胞活化机制提供新的理论和实验依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

主要材料和试剂：新生昆明乳鼠（中国医科大学实验动物部），DMEM培养基（美国Invitrogen公司），胎牛血清（美国塔克拉公司），兔抗phosph-PDGFRα（英国Abcam），兔抗phosph-PI3K、兔抗phosph-Akt（Ser473）（美国Signalway Antibody），胶质纤维酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein，GFAP）抗体（美国Millipore公司），FITC488荧光标记二抗（中杉金桥技术公司）。

主要仪器：恒温CO₂培养箱（Thermer371，美国Thermo公司），低温高速离心机（CF16RXⅡ，日本HITACHI公司），荧光显微镜（Eclipse 80i，日本Nikon公司），电泳仪及转膜仪、凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），电子分析天平（ER182，日本艾安德得公司），酶标板震荡仪（RS-2，北京昊诺斯科技有限公司）。

1.2 细胞的培养、鉴定和分组

将新生1~3 d昆明小鼠的乳鼠，乙醇消毒，迅速断头取脑。显微镜下剥离脑膜后，取大脑皮质部分，剪碎，0.25%胰酶消化。终止消化后，4 ℃条件下1 000 r/min离心，加含有10%胎牛血清的DMEM培养液将细胞浓度调至1×10⁵/mL。接种于25 cm²培养瓶中，37 ℃、5% CO₂条件下在细胞孵育箱中进行培养。2 d后换液，以后根据细胞生长状态2~3 d换液。待细胞生长贴壁铺满瓶底80%左右时，胰酶消化进行传代。

传代至3代以后，0.25%胰酶消化，离心后取上清，加完全培养基调整细胞浓度为1×10⁴/mL。接种于放置有无菌盖玻片的6孔板中，每孔加入1.5 mL细胞悬液，置于37 ℃、5% CO₂条件下进行培养。镜下观察细胞长满瓶底80%左右时，进行免疫荧光染色。若免疫荧光染色GFAP阳性表达在90%以上，则表明星形胶质细胞纯度较高，可以进行后续实验。

实验分为4组：对照组，共培养体系未加任何处理因素，换无血清DMEM培养液；PDGF-BB组，浓度10 ng/mL PDGF-BB作用细胞24 h；AG1296组，浓度10 μmol/L AG1296作用细胞24 h；PDGF-BB+AG1296组：浓度10 μmol/L AG1296作用细胞2 h后，加入浓度10 ng/mL的PDGF-BB。

1.3 免疫荧光染色

取培养细胞，弃掉培养基，PBS冲洗3次，加4%多聚甲醛固定液进行固定。10 min后吸除多聚甲醛，PBS清洗3次，加Triton透膜10 min，PBS清洗3次，0.5%牛血清白蛋白封闭30 min，加入兔抗GFAP的单克隆抗体（1:500），4 ℃孵育过夜。第2天室温孵育15 min，PBS清洗3次，加入新鲜配制的抗兔荧光二抗FITC（绿光），后续实验都在避光条件下进行。37 ℃孵育90 min，PBS清洗3次，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜镜下观察并拍照。

1.4 Western blotting

蛋白提取：用0.9%生理盐水清洗细胞悬液，添加细胞体积4倍的含1% PMSF的RIPA裂解液之后，超声粉碎机粉碎，4 ℃裂解30 min。采用紫外分光光度法测定蛋白浓度，取上清液，配置上样体系，按照15 µL上样，加入loading buffer并使其终浓度为1×，不足体积用PBS补齐，100 ℃、5 min蛋白变性后-80 ℃保存。配置分离胶和浓缩胶，移液器加样，浓缩胶内电泳的电压设为80 V，进入分离胶后转换为120 V。按阴极-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-阳极的顺序排列转膜，用含5%血清的TBST溶液37 ℃封闭1 h，加入一抗稀释液GAPDH（1:10 000）、p-PDGFR-α（1:200）、PDGFR-α（1:200），p-PI3K（1:500）、PI3K（1:500），p-Akt（1:500）、Akt（1:500），GFAP（1:3 000）4 ℃冰箱内摇床上孵育过夜，TBST清洗10 min×3次，加入羊抗兔二抗（1:5 000）室温下孵育2 h，弃去二抗工作液，TBST漂洗10 min×3次，ECL发光用BIO-RAD凝胶电泳图像分析仪进行采图，应用图像分析软件（美国National Institutes of Health）对灰度值进行统计分析，检测各指标的表达强度。

1.5 统计学分析

数据用x±s表示，所有实验重复进行3次。应用GraphPad Prism5软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Bonferroni检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞

GFAP免疫荧光染色结果（图 1）显示，传代3次以上的星形胶质细胞GFAP阳性表达高于95%。因此，确认体外培养的脑皮质星形胶质细胞的纯度可以进行后续实验。

2.2 PDGF-BB诱导星形胶质细胞的活化表达

Western blotting结果（图 2）显示，与对照组相比，PDGF-BB组GFAP蛋白表达明显增高（P < 0.01）。免疫荧光GFAP染色结果（图 3）显示，PDGF-BB可以诱导体外培养的脑皮质星形胶质细胞活化。与对照组相比，PDGF-BB组星形胶质细胞胞体肥大，突起变短变粗，GFAP阳性表达增强，说明PDGF-BB可以促进星形胶质细胞的活化表达。

2.3 PDGFR/PI3K/Akt信号通路参与PDGF-BB诱导的星形胶质细胞的增殖

Western blotting检测结果（图 4）显示，与对照组比较，PDGF-BB组体外培养的脑皮质星形胶质细胞中p-PDGFRα、p-PI3K和p-Akt的表达均明显增强（P < 0.01），而AG1296组细胞p-PDGFR、p-pI3K和p-Akt的表达没有明显变化；PDGF-BB+AG1296组应用抑制剂AG1296后再给予PDGF-BB刺激，星形胶质细胞p-PDGFRα、p-pI3K和p-Akt的表达分别被明显抑制（P < 0.05）。说明PDGF-BB可以调控脑皮质星形胶质细胞中PDGFR和Akt信号通路的活化表达。

2.4 抑制PDGFR/PI3K/Akt信号通路活化可减弱PDGF-BB诱导的星形胶质细胞活化表达

采用Western blotting检测星形胶质细胞中GFAP蛋白表达，应用抑制剂AG1296可减少星形胶质细胞中GFAP蛋白的表达，见图 5。对培养的星形胶质细胞进行免疫荧光GFAP染色检测，结果发现，应用PDGFR信号通路抑制剂AG1296后，与对照组相比，PDGF-BB诱导的星形胶质细胞活化状态均有所改善，具体表现为GFAP阳性表达减弱，胞体肥大减轻等。说明抑制PDGFR信号通路的活化可减弱PDGF-BB诱导的星形胶质细胞活化。见图 6。

3 讨论

星形胶质细胞是脑中数量最多的非神经元细胞，也是神经系统内分布最广泛的胶质细胞，能合成分泌多种神经递质、激素及神经营养因子，具有维持神经元内外环境、免疫调节和信号转导等功能^[6]。外伤性或缺血性脑损伤后，星形胶质细胞发生活化，出现增殖、表型变化和细胞肥大，GFAP表达增加，成为反应性星形胶质细胞，并在阻碍神经损伤修复的过程中扮演了重要角色^[7]，如增殖的胶质细胞会沿着损伤部位迁移，最终在损伤周围形成胶质瘢痕；胶质细胞的过度活化，会产生大量黏附分子/细胞因子/生长因子受体，如白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α和转化生长因子-β1，促进炎症反应，加剧神经元的损伤甚至导致其死亡。本研究结果显示，给予PDGF-BB刺激后星形胶质细胞增殖增多细胞胞体肥大，突起变短变粗，说明体内损伤激活星形胶质细胞可以通过体外培养星形胶质细胞并用PDGF-BB刺激来模仿。

本研究体外培养小鼠乳鼠的脑皮质星形胶质细胞，经纯化鉴定后，应用PDGF-BB诱导其活化表达，模拟体内脑损伤后炎性细胞因子释放导致的星形胶质细胞活化表达。PDGF-BB诱导后，星形胶质细胞发生活化，Western blotting结果显示，p-Akt、p-pI3K以及p-PDGFRα蛋白在星形胶质细胞中的表达明显增高，说明活化后的星形胶质细胞激活了PDGFR/PI3K/Akt信号通路；应用这条信号通路的抑制剂AG1296预处理星形胶质细胞后，再进行PDGF-BB的诱导活化，免疫荧光染色和Western blotting结果发现，星形胶质细胞的活化表达情况如细胞形态、GFAP表达均有所改善。由此说明，PDGFR/PI3K/Akt信号通路参与PDGF-BB诱导的星形胶质细胞活化表达过程，抑制这条信号通路的活化可以有效改善星形胶质细胞的活化表达。

创伤性脑损伤后，星形胶质细胞发生活化^[8-9]，炎性细胞因子如白细胞介素-1β、白细胞介素-6以及肿瘤坏死因子-α等表达增多^[10-11]，胶质细胞的过度活化表达正反馈调节炎性细胞因子的表达，炎性细胞因子的过度释放同样正反馈调控胶质细胞的活化，这样就在胶质细胞过度活化和炎性细胞因子过度释放之间形成一个恶性循环，进一步加剧神经元的损伤，甚至导致其死亡，最终对神经功能产生严重影响。PI3K/Akt是PDGFR的下游分子，其信号转导通路包括PI3K、Akt、PTEN及mTOR等分子，参与控制细胞的多种生物学行为，包括细胞的增殖、凋亡、自噬、转录、翻译、细胞骨架重排及细胞周期调控等^[12-16]。为进一步探究PDGFR信号通路对脑损伤导致的星形胶质细胞活化的影响，本研究建立体外诱导星形胶质细胞活化模型，即PDGF-BB诱导小鼠乳鼠脑皮质星形胶质细胞的活化。应用PDGFR信号通路抑制剂AG1296抑制PDGFR、PI3K、Akt的活化，探究其对PDGF-BB诱导的星形胶质细胞活化表达的影响，即间接探究PDGFR信号通路对胶质细胞活化表达的影响。结果显示，抑制PDGFR信号通路活化可以减弱PDGF-BB诱导的星形胶质细胞活化。本研究结果与以往研究结论一致。而作用的具体机制，仍需更精确缜密的实验进行验证。