中国医科大学学报  2019, Vol. 48 Issue (10): 926-930, 954

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王楠, 王姣琦, 马明, 徐中航, 徐忠信
WANG Nan, WANG Jiaoqi, MA Ming, XU Zhonghang, XU Zhongxin
白藜芦醇通过AKT/mTOR信号通路改善慢性脑低灌注大鼠认知功能障碍
Resveratrol Improves Cognitive Dysfunction in Rats with Chronic Cerebral Hypoperfusion through the AKT/mTOR Signaling Pathway
中国医科大学学报, 2019, 48(10): 926-930, 954
Journal of China Medical University, 2019, 48(10): 926-930, 954

文章历史

收稿日期:2018-09-19
网络出版时间:2019-09-27 11:39
白藜芦醇通过AKT/mTOR信号通路改善慢性脑低灌注大鼠认知功能障碍
王楠1,2 , 王姣琦1 , 马明1 , 徐中航3 , 徐忠信1     
1. 吉林大学中日联谊医院神经内科, 长春 130033;
2. 辽宁省人民医院神经内科, 沈阳 110016;
3. 吉林大学中日联谊医院普外科, 长春 130033
摘要目的 探究白藜芦醇对慢性脑低灌注大鼠认知功能障碍的改善作用,以及AKT/mTOR信号通路在其中的调控机制。方法 采用永久结扎双侧颈总动脉法制作慢性脑低灌注大鼠模型。随机将大鼠分为假手术组、慢性脑低灌注模型组、白藜芦醇+慢性脑低灌注组,每组30只。采用Morris水迷宫定向航行试验和空间探索试验评价大鼠认知功能;采用神经功能缺损评分测试大鼠行为学;采用HE染色观察大鼠额颞叶皮层、海马区病理学改变以及神经元丢失情况;采用TUNEL染色检测神经元凋亡;采用Western blotting检测AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况。结果 白藜芦醇能改善由于长期低灌注造成的大鼠行为学损伤以及认知功能障碍。白藜芦醇治疗后,海马萎缩现象得到改善,神经元丢失和形态学异常现象得到缓解;大鼠神经元细胞凋亡率下降,抑制慢性低灌注大鼠脑组织AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达。结论 白藜芦醇对慢性脑低灌注大鼠认知功能障碍具有改善作用,这种作用可能是通过AKT/mTOR信号通路调控的。
关键词慢性脑低灌注    白藜芦醇    AKT/mTOR    
Resveratrol Improves Cognitive Dysfunction in Rats with Chronic Cerebral Hypoperfusion through the AKT/mTOR Signaling Pathway
1. Department of Neurology, China-Japan Friendship Hospital Affiliated Jilin University, Changchun 130033, China;
2. Department of Neurology, People's Hospital of Liaoning Province, Shenyang 110016, China;
3. Department of General Surgery, China-Japan Friendship Hospital Affiliated Jilin University, Changchun 130033, China
Abstract: Objective To investigate the effects of resveratrol on cognitive dysfunction in rats with chronic cerebral hypoperfusion (CCH) and its regulation mechanism via the AKT/mTOR signaling pathway. Methods A CCH rat model was established by bilateral carotid artery occlusion. The rats were randomly divided into sham operation, CCH, and resveratrol + CCH groups (n=30 in each group). The cognitive function of the rats was evaluated using the Morris water maze, including the directional navigation and space exploration tests. Behavior changes were identified on the basis of the neurological deficit score. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the pathological changes of the frontotemporal cortex and hippocampus and to determine the condition of neuron loss. The TUNEL assay was used to detect neuronal apoptosis. Western blotting was used to detect the expression of the AKT/mTOR signaling pathway-related proteins. Results Resveratrol improved the behavioral impairment and cognitive dysfunction of the CCH rats. After resveratrol treatment, the hippocampal atrophy was improved, and the neuronal loss and morphological abnormalities were alleviated. The apoptosis rate of the neuronal cells decreased under the resveratrol treatment, which also inhibited the expressions of the AKT/mTOR signaling pathway-related proteins in brain tissue. Conclusion Resveratrol can improve the cognitive dysfunction of CCH rats, and this effect may be regulated by the AKT/mTOR signaling pathway.
Keywords: chronic cerebral hypoperfusion    resveratrol    AKT/mTOR    

慢性脑灌注不足又称慢性脑血流灌注不足,是一种临床常见的脑缺血损伤,是血管性痴呆、阿尔茨海默病和Binswanger病等多种神经系统疾病或精神疾病发生发展过程中的病理因素。文献[1]报道,长期脑血流灌注不足导致能量代谢障碍、氧化应激产生、炎性细胞因子释放、神经细胞凋亡,进而造成了认知功能受损。研究[2]显示,蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路能够通过整合细胞内外信号控制细胞生长与凋亡,而AKT是一种能够调控神经元凋亡的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,通过其磷酸化及活化作用,广泛调节细胞活性。mTOR是控制细胞蛋白合成与细胞凋亡的关键蛋白激酶,在细胞增殖和凋亡中发挥作用[3]

白藜芦醇是一种具有多种生物活性的多酚类植物抗毒素,具有保护神经、抑制神经元凋亡的作用。研究[4-5]显示,白藜芦醇对阿尔茨海默病等中枢神经退行性疾病有很好的预防作用。白藜芦醇的抗炎、抗氧化等多种保护性生理作用有助于改善由于长期低灌注而造成的认知功能障碍[6]。本研究探讨了白藜芦醇对慢性脑低灌注大鼠认知功能障碍的改善作用,以及AKT/mTOR信号通路在其中的调控机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物与分组

SPF级SD大鼠90只,260~300 g,雄性,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证号:SCXU(京)20120007。动物实验在中国医科大学实验动物部屏障系统中进行,实验动物使用许可证号:SYXK(辽)2013001。本研究经中国医科大学实验动物福利与伦理委员会批准(2017114)。采用随机数字表法,将大鼠分为3组:假手术组(Sham组)、慢性脑低灌注模型组(CCH组)、白藜芦醇+慢性脑低灌注组(Res组),每组30只。

1.2 动物模型制备

采用永久结扎双侧颈总动脉法制作慢性脑低灌注大鼠模型。各组实验动物术前12 h禁食,但不禁水。腹腔注射2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)进行麻醉。大鼠取仰卧位,固定后颈部备皮并消毒,于颈部正中切口,分离双侧颈总动脉和迷走神经。CCH组:于远心端,用4号手术线永久结扎双侧颈总动脉,逐层缝合关闭组织,皮下注射庆大霉素防止感染,术后大鼠苏醒后,放回笼具饲养。Res组:采用上述方式建立模型,建模后每天灌胃白藜芦醇(50 mg/kg)。Sham组:分离双侧颈总动脉不结扎,每天灌胃等体积的生理盐水。分别于灌胃3、6、9周,从每组取10只大鼠用于神经功能评分和水迷宫检测。检测结束后取脑组织样本,一部分置4%多聚甲醛中固定,另一部分置-80℃低温冰箱中保存。

1.3 神经功能评分

本研究以Bederson神经功能缺损评分方法[7]为评价标准,观察各组大鼠的症状,记录神经功能缺失症状,对大鼠神经功能进行评分。0分:正常,无神经损伤症状;1分:提尾时病灶对侧前肢屈曲,不能完全伸直;2分:行走时向瘫痪侧转圈;3分:向病灶对侧跌倒;4分:意识丧失,不能自发行走。

1.4 Morris水迷宫检测

以Morris水迷宫定向航行试验和空间探索试验为标准,对各组大鼠进行学习记忆功能测试。定位航行实验:历时5 d,观察大鼠在迷宫内寻找平台的时间。令大鼠面向池壁,分别于4个入水点放入水中,记录在3 min内寻找到并爬上平台的时间(即逃避潜伏期)和在此期间行走的路径(即游泳距离),每日2次。大鼠每次在3 min内寻找到并爬上平台的时间为大鼠的记忆成绩,连续4 d,计算平均成绩。空间探索试验:用于检测大鼠学会寻找平台后对平台空间位置的记忆能力。在定位航行试验后去除平台,然后任选一个入水点将大鼠放入水池中,记录其在180 s内跨过原平台所在位置的次数。

1.5 HE染色

取多聚甲醛中固定的组织样本,经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡,制作石蜡包埋蜡块,切片后进行HE染色,苏木素染色10 min,盐酸乙醇分化30 s,伊红染色1 min,流水冲洗,脱水、透明、中性树胶封片,光镜下观察脑额叶皮层和海马神经元病理组织学变化。

1.6 TUNEL染色

采用TUNEL试剂盒检测脑神经细胞凋亡。取每组各时间点大鼠脑组织,常规脱水、包埋和切片;0.9% NaCl孵育5 min,以PBS冲洗2次,倒出液体后加入生物素化核苷酸和末端脱氧核苷酸转移酶(1:500稀释),充分混匀后覆盖塑料盖玻片,37 ℃孵育60 min,用含0.3%过氧化氢的PBS再次冲洗。PBS浸洗3次后,加入用辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素,室温下孵育30 min,再以PBS冲洗,显微镜下观察拍照。

1.7 Western blotting检测AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况

取每组各时间点大鼠冰冻脑组织,置于含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中,于冰上裂解30 min后离心,取上清蛋白液;测定蛋白浓度,在蛋白电泳、转膜、封闭后,加入稀释的(1:1 000)AKT、mTOR、S6K1和4E-BP1抗体,孵育过夜(4 ℃),TBST清洗PVDF膜后加入二抗,辣根过氧化物酶标记,室温孵育2 h,GAPDH为内参,ECL发光试剂盒和凝胶成像系统对蛋白进行显色,使用Image Tools进行吸光度分析后得到结果。

1.8 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行分析,计量资料以x±s表示,组内差异性分析采用t检验,组间差异性分析采用单因素方差分析,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 神经功能评分

采用Bederson法评估大鼠神经元评分。组间比较显示:双侧颈总动脉结扎3、6、9周时,与Sham组相比,CCH组和Res组神经功能评分均明显升高(P < 0.05);与CCH组相比,Res组神经功能评分降低,其中6和9周时的差异有统计学意义(P < 0.05)。组内比较显示:CCH组中,与3周时相比,6和9周时神经功能评分明显升高(P < 0.05),其中9周时最高;Res组中,与3周时相比,6和9周时神经功能评分显著降低(P < 0.05),其中9周时降低最为明显。见表 1

表 1 3组大鼠各时间点神经功能缺损评分、逃避潜伏期和游泳距离 Tab.1 Neurological deficit scores, escape latency, and swimming distance at each time point in the three groups of rats
Item Sham group(n = 30) CCH group(n = 30) Res group(n = 30)
Neurological deficit score      
  3 weeks 0±0 2.35±0.391) 2.24±0.251)
  6 weeks 0±0 3.13±0.351),3) 1.94±0.221),2),3)
  9 weeks 0±0 3.48±0.201),3),4) 1.55±0.371),2),3),4)
Escape latency(s)      
  3 weeks 10.43±5.41 48.21±4.611) 41.37±5.421)
  6 weeks 11.45±2.45 56.45±5.381),3) 32.95±4.371),2),3)
  9 weeks 10.48±5.27 68.72±4.111),3),4) 15.37±4.572),3),4)
Swimming distance(cm)      
  3 weeks 107.85±6.28 259.69±23.041) 254.45±16.751)
  6 weeks 102.62±11.52 390.58±29.321),3) 170.68±20.941),2),3)
  9 weeks 106.81±9.42 501.57±27.231),3),4) 112.04±13.612),3),4)
1)P < 0.05 vs the sham group at the same time point;2)P < 0.05 vs the CCH group at the same time point;3)P < 0.05 vs 3 weeks within the group;4)P < 0.05 vs 6 weeks within the group.

2.2 Morris水迷宫检测

通过Morris水迷宫定向航行试验和空间探索试验检测每组各时间点大鼠认知功能损伤情况。组间比较显示:与Sham组相比,CCH组逃避潜伏期和游泳距离均延长,3、6、9周时的差异均有统计学意义(P < 0.05);与Sham组相比,Res组逃避潜伏期和游泳距离均延长,其中6和9周时的差异有统计学意义(P < 0.05);与CCH组相比,Res组逃避潜伏期和游泳距离均缩短,其中6和9周时的差异有统计学意义(P < 0.05)。组内比较显示:CCH组中,与3周时相比,6和9周时逃避潜伏期和游泳距离均延长(P < 0.05),其中9周时的逃避潜伏期和游泳距离最长(P < 0.05);Res组中,与3周相比,6和9周时逃避潜伏期和游泳距离均缩短(P < 0.05),其中9周时的逃避潜伏期和游泳距离最短。见表 1

2.3 HE染色

双侧颈总动脉结扎3、6、9周时,CCH组和Res组大鼠海马和额叶皮层均有损伤,其中CCH组损伤较重,额叶皮层神经元固缩变性,海马区细胞结构疏松,海马萎缩、神经元变性坏死;与CCH组大鼠相比,Res组3个时间点大鼠额叶皮层及海马区细胞结构和神经元形态得以修复,神经元变性坏死现象得到改善。组内比较显示:CCH组中,随着双侧颈总动脉结扎时间延长损伤加重,在9周时损伤最重;Res组中,与3周相比,损伤程度有所下降,尤其在9周时,额叶皮层和海马区神经元变性有明显改善。见图 1

图 1 额叶皮层区和海马区HE染色结果×200 Fig.1 Hematoxylin-eosin staining of the frontal cortex and hippocampus area ×200

2.4 TUNEL染色发现白藜芦醇具有抑制神经元凋亡的作用

TUNEL法观察各组大鼠额叶皮层及海马区神经元凋亡情况。组间比较显示:双侧颈总动脉结扎3、6、9周后,与Sham组相比,CCH组大鼠额叶皮层及海马区神经元凋亡明显增加;与CCH组相比,Res组额叶皮层及海马区神经元凋亡明显降低。组内比较显示:CCH组中,与3周相比,6和9周时额叶皮层及海马区神经元凋亡明显增加,其中9周时凋亡最重;Res组中,与3周相比,6和9周时额叶皮层及海马区神经元凋亡现象得到抑制,且9周时额叶皮层及海马区神经元凋亡细胞较少。见图 2

图 2 额叶皮层和海马区TUNEL染色结果×200 Fig.2 TUNEL staining of the frontal cortex and hippocampus area ×200

2.5 AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况

与Sham组相比,CCH组3、6、9周后脑组织AKT、mTOR、S6K1和4E-BP1表达量升高,9周时AKT、mTOR、S6K1和4E-BP1的表达量最高。与CCH组相比,Res组AKT、mTOR、S6K1和4E-BP1的表达量受抑制,随灌胃时间延长,Res组9周时相关蛋白表达量降至最低。结果提示,白黎芦醇可以抑制慢性低灌注大鼠脑组织AKT以及mTOR蛋白表达,抑制了磷酸化蛋白的产生,从而使S6K1和4E-BP1蛋白表达降低,进而实现了神经元细胞凋亡的抑制。见图 3

Expression levels of the related proteins after (A) 3, (B) 6, and (C) 9 weeks. #P < 0.05 vs the sham group; *P < 0.05 vs the CCH group. 图 3 AKT/mTOR信号通路相关蛋白Western blotting结果 Fig.3 Western blotting results of the AKT/mTOR signaling pathway-related proteins

3 讨论

认知功能障碍是一种与年龄相关的疾病,其发病原因多种多样,慢性脑缺血造成的认知功能障碍是临床常见的致病原因之一[8]。脑部额叶皮层及海马区的大量神经元细胞对于维持正常学习及认知能力有重要作用。慢性脑缺血导致脑组织长期处于低氧低灌注状态,致使脑内大量神经元衰竭坏死、甚至凋亡[9]。严重的氧化应激反应也加速诱导了细胞凋亡进程。这些都是引起认知功能障碍的主要原因。白藜芦醇能缓解神经轴突变性,发挥神经保护作用,抑制海马神经元凋亡[10-11]。有研究显示,白藜芦醇能通过AKT/mTOR信号通路影响癌细胞的增殖与活性。因此,本研究建立大鼠慢性脑低灌注模型,并于成功建模后每天灌胃白藜芦醇(50 mg/kg)治疗,探究白藜芦醇对慢性脑低灌注大鼠学习认知能力的改善能力以及神经元保护作用,进一步探究AKT/mTOR信号通路在此过程中的调控机制。

白藜芦醇能够有效的促进新陈代谢、延缓衰老,具有广泛的生物活性[12]。研究[13]显示,白藜芦醇能通过预防神经元变性,改善血管性痴呆动物的认知功能损伤。本研究HE染色结果显示,慢性脑缺血能造成额叶皮层及海马区细胞结构疏松,海马萎缩,神经元大量丢失,残留神经元呈空泡样变性。这些结果提示,慢性脑缺血导致了神经元变性,这也是致使神经元凋亡的病理基础。经过白藜芦醇治疗后,海马萎缩以及神经元变性减轻,神经元丢失现象减少,提示白藜芦醇能够改善慢性脑缺血疾病对脑部额叶皮层及海马区的病理损伤。进一步采用Tunel染色观察各组大鼠神经元凋亡情况,结果显示,随灌胃时间延长,凋亡率逐渐降低,提示白藜芦醇能通过抑制神经元凋亡,实现对脑部额叶皮层及海马区的保护作用。

AKT/mTOR信号通路是一条经典的抗凋亡通路,参与多种细胞活动,与细胞生存周期、细胞增殖凋亡密切相关。近年来有大量研究[14-15]显示,通过调节该通路,能起到预防和改善神经变性疾病的作用。本研究对每组各时间点大鼠脑组织中AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况进行检测,CCH组大鼠AKT、mTOR、S6K1和4E-BP1表达量升高,而经过白藜芦醇治疗后,Res组AKT、mTOR、S6K1和4E-BP1的表达量受抑制,并且随着治疗时间的延长,Res组相关蛋白的表达量逐渐趋于Sham组。这些结果提示,白藜芦醇能够通过抑制神经元凋亡,实现对慢性脑低灌注大鼠认知功能障碍的改善作用。而这种保护作用可能与AKT/mTOR信号通路有关。

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