多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种T细胞介导的主要累及中枢神经系统(central nervous system, CNS)白质的特异性炎性脱髓鞘性自身免疫性疾病, 具有高致残、高复发的特点。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是国际上公认的研究MS的理想动物模型。MS和EAE的基本病理过程相似, 外周髓鞘抗原特异性T细胞通过分子模拟机制被初次激活, 穿过血脑屏障(blood brain barrier, BBB)进入CNS, 之后被再次激活, 释放各种有害物质并诱发一系列瀑布样异常免疫应答反应。近年来, 我国MS的发病率呈不断上升趋势。西药治疗MS效果差, 不良反应大, 因此有不少学者致力于从中草药中寻找有效的成分, 积极探索寻找新的治疗药物。黄芪为豆科多年生草本植物的干燥根, 具有补中益气之功效, 作为一种具有较强免疫调节作用的中药, 广泛应用于免疫性疾病的临床治疗^[1-2]。黄芪糖蛋白(Huangqi glycoprotein, HQGP)是从中药黄芪中提取纯化的一种天然植物糖蛋白, 本课题组的前期研究^[3-4]发现HQGP对EAE小鼠有一定的抗炎作用, 因此推测其对EAE的BBB可能具有保护作用, 并可能是抑制炎症细胞入侵, 减轻临床症状的重要原因。因此, 本研究拟探讨HQGP对EAE小鼠BBB通透性的影响及其作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物

选取健康清洁级雌性C57BL/6小鼠40只, 8~10周龄, 体质量18~22 g, 于标准动物饲养室内饲养1周后制造EAE模型, 所有动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.1.2 主要试剂

小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55 (myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55, MOG 35-55)购自西安联美生物科技有限公司; 百日咳毒素(pertussis toxin, PTX)由瑞士Alexis公司提供; 结核分支杆菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)购自美国BD公司; 完全Freund佐剂(complete Freund’s adjuvant, CFA)、兔抗小鼠CD4和CD68单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)购自英国AbD Serotec公司; Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔二抗购自美国Invitrogen公司。其他试剂为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 EAE小鼠模型制备

随机将C57BL/6雌性小鼠分为EAE组和HQGP组, 每组20只。MOG35-55的配制与注射均严格参照文献[5]进行, 免疫当天记为免疫后0 d (the 0 day post-immunization, d0 p.i.), 2组小鼠于d0 p.i.和d2 p.i.均给予腹腔注射PTX增强免疫2次(500 ng/只)。HQGP组在d3 p.i.开始腹腔注射HQGP [1 mg/ (kg·d)], 持续给药15 d。

1.2.2 状态观察与评分

每天由2人对各组小鼠的一般状态进行观察, 并对运动功能进行评分, 观察内容包括饮水、摄食、毛发色泽、体质量、运动功能、发病情况等, 记录测量结果。运动功能评分标准采用国际通用的5分法^[6], 计算平均起病时间(组内每只动物首发症状天数的均值)和平均高峰评分(组内每只动物最高评分的均值)。

1.2.3 脑组织含水量的测定

免疫后第18天, 每组各取5只小鼠, 快速断头, 在冰盒中完整剥离脑组织并称质量(脑组织湿质量), 再将脑组织放入52 ℃电热恒温箱烘烤72 h, 再称质量(脑组织干质量)。计算脑组织含水量= (脑组织湿质量-脑组织干质量) /脑组织湿质量。

1.2.4 BBB通透性的检测

免疫后第18天, 每组各取5只小鼠, 末次给药1 h后, 尾静脉注射2%伊文思蓝(evans blue, EB) 100 μL/只。以小鼠的眼结膜、四肢、全身皮肤出现明显蓝染为注射成功, 100 g/L水合氯醛麻醉后行生理盐水灌流, 冰盒中迅速剥离脑组织, 称质量并记录脑组织湿质量。然后加甲酰胺溶液浸泡, 45 ℃避光孵育72 h, 充分匀浆后, 15 000 r/min离心20 min。在酶标仪上630 nm处测定上清液吸光度值(A)。根据EB标准曲线求出EB含量, 用EB浓度(μg·mL^-1) /脑湿质量(μg·g^-1)表示。

1.2.5 病理标本采集及处理

免疫后第18天, 每组各取5只小鼠, 100 g/L水合氯醛麻醉后行4%多聚甲醛灌流, 分离脊髓组织, 用冰冻切片包埋剂(optimal cutting temperature compound, OCT)包埋, 置液氮蒸汽中凝固后, 迅速放入-80 ℃冰箱冻存。制作冰冻切片, 厚度10 μm, 然后行免疫荧光染色。

1.2.5.1 HE染色

于水中浸泡脊髓冰冻切片2 min, 苏木精染色10 min, 水洗1 min, 5%盐酸乙醇分化15 s, 伊红染色30 s, 梯度乙醇脱水, 二甲苯透明, 甘油封片后, 显微镜下观察炎症细胞浸润情况。

1.2.5.2 LFB髓鞘染色

95%乙醇浸泡取脊髓冰冻切片3 min, 固蓝液中57 ℃孵育24 h, 去离子水浸洗3 min, 95%乙醇浸洗3 min, 0.05%碳酸锂溶液浸泡15 s, 70%乙醇分化至灰白质清晰可辨, 去离子水迅速冲洗3 min, 常规梯度乙醇脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片, 显微镜观察髓鞘脱失情况。使用Image Pro Plus软件计算小鼠髓鞘脱失面积与白质面积比值。

1.2.6 免疫荧光染色

取脊髓冰冻切片, 室温晾干, PBS洗5 min×3次, 10 g/L BSA-PBS室温封闭1.5 h后, 分别加入1:1 000稀释的兔抗小鼠CD4和CD68抗体, 4 ℃过夜; 次日于室温下再用PBS洗5 min×3次, 滤纸吸干, 加入Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔二抗, 室温下孵育2 h, PBS洗5 min×3次, 50%甘油封片, 荧光显微镜下观察拍照。使用Image Pro Plus软件统计每个完整切面的炎症细胞数量, 比较2组每个完整切面CD4⁺和CD68⁺细胞数, 分析炎症细胞浸润情况。

1.2.7 Western blotting检测紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达

脊髓组织提取蛋白定量后, 加入5×上样Buffer, 用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白, 湿转至硝酸纤维膜, 5%脱脂奶粉封闭2 h, 分别加入1:1 000稀释的兔抗小鼠Occludin、ZO-1和GADPH一抗, 4 ℃过夜; 次日TBST洗涤后, 加入1:5 000稀释的HRP标记的二抗, 37 ℃孵育2 h, TBST洗涤后进行化学发光反应, 用Bio-RAD凝胶成像仪分析条带, 用Band Scan分析2组Occludin和ZO-1的灰度值与内参GAPDH的灰度值比值, 并进行统计学分析。

1.3 统计学分析

采用统计分析软件GraphPad Prism 5.0进行统计分析处理, 2组间实验数据的比较采用Student-t检验, P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 HQGP对EAE小鼠症状和病变的影响

与前期研究^[7]结果一致, 与EAE模型组比较, HQGP治疗可减轻EAE症状, 延缓发病。病理结果显示, HQGP治疗可显著降低炎症细胞向脊髓组织浸润, 降低髓鞘脱失面积。

2.2 脑组织含水量及BBB通透性检测结果

免疫后18 d, HQGP组小鼠脑内水、EB含量均低于EAE组(P＜0.05, P＜0.01)。见图 1和表 1。

2.3 2组小鼠脊髓炎症细胞浸润情况

2组脊髓腰骶段横断面冰冻切片免疫荧光染色显示, CD4⁺T细胞和CD68⁺巨噬细胞主要在脊髓白质区表达, 且EAE组CD4⁺T细胞数(114.3±11.84)高于HQGP组(46.0±6.72), 差异有统计学意义(P＜0.001), 提示HQGP能明显减轻CD4⁺T细胞向脊髓的浸润; EAE组CD68⁺巨噬细胞数(102.70±12.26)显著高于HQGP组(35.33±13.08), 差异有统计学意义(P＜0.001), 提示HQGP能明显减少CD68⁺巨噬细胞浸润数量。见图 2。

2.4 2组小鼠紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达情况

Western blotting结果显示, HQGP组小鼠脊髓内细胞紧密连接蛋白Occludin表达水平(2.01±0.14)较EAE组(0.94±0.07)增高, HQGP组小鼠脊髓内细胞紧密连接蛋白ZO-1的表达水平(2.37±0.20)较EAE组(0.964±0.14)增加, 差异均有统计学意义(均P＜0.001)。见图 3。

3 讨论

MS及其EAE动物模型广泛用于涉及T细胞介导的炎症性疾病的研究, 其特征为淋巴细胞浸润、脱髓鞘和轴突损伤^[8]。BBB功能障碍是EAE和MS进展的主要特征之一, 炎性细胞因子通过受损的BBB迁移至大脑, 导致脑水肿、脱髓鞘和神经细胞死亡^[9]。传统中医药可用于治疗复杂多变的MS, 不良反应少^[10]。HQGP是一种从黄芪中提取的有效成分, 对MS/EAE中的神经保护和免疫调节有积极作用^[11]。本研究探讨了HQGP对EAE小鼠瘫痪症状的潜在保护作用, 结果表明HQGP延迟了EAE的发作, 改善了EAE的严重程度, 且HQGP对EAE的治疗作用至少有一部分是通过强化BBB完整性及抗炎作用介导的。

在EAE的复杂过程中, 涉及免疫系统的各种细胞, 包括CD4⁺Th1和Th17, γδT细胞, CD8⁺T细胞, Treg细胞和巨噬细胞^[12]。CNS的炎症浸润主要是由活化的T细胞和巨噬细胞组成^[13]。这也说明MS病程中BBB破坏, 从而使循环血液中炎症细胞穿过BBB浸润至CNS。免疫荧光标记表明, HQGP处理后, 浸润的CD4⁺T细胞和CD68⁺巨噬细胞数显著减少。证明HQGP可抑制免疫细胞向脊髓的浸润, 从而有助于改善脊髓的炎症微环境, 从而提高EAE临床评分。

EB染料广泛用于检测BBB渗漏, 因为它与血清白蛋白结合形成大分子复合物, 在正常生理环境下不能穿过完整的BBB。因此, 本研究将EB染料进入大脑的量作为BBB渗透性的指标。结果表明, 与EAE小鼠相比, HQGP处理显著降低了脑中EB的含量。说明HQGP能防止EAE小鼠模型BBB的破坏。

内皮细胞间紧密连接(tight junction, TJ)由大的多蛋白复合物组成, 是构成BBB的主要成分之一, 紧密连接蛋白主要由跨膜蛋白Occludin、claudins和胞质蛋白ZO-1组成。Occludin的作用是连接跨膜蛋白和细胞骨架, 影响肌动蛋白的收缩性, 影响TJ的功能, 从而使BBB的通透性明显低于其他屏障性结构^[14]。有研究^[15]认为Occludin表达水平可以表明BBB的结构功能状态, 其下降程度可以作为BBB损伤程度的标志。而ZO-1是与TJ相关的主要细胞质蛋白。其作用是将Occludin和claudins的COOH末端连接到潜在的肌动蛋白细胞骨架, 据文献^[16]报道, ZO-1或Occludin表达的减少能导致BBB通透性增加。本研究结果显示, HQGP治疗可使EAE小鼠脊髓组织内Occludin和ZO-1的表达增加, 表明HQGP能有效地防止EAE模型小鼠中BBB的破坏, 促进BBB功能的修复。

总之, 本研究表明HQGP可以抑制EAE小鼠CNS炎症细胞浸润, 改善脱髓鞘程度, 促进BBB损伤修复, 具体机制可能与上调紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达, 抑制炎症细胞向CNS迁移有关。