双酚A（bisphenol A，BPA）是一种广泛存在的环境内分泌干扰物，可以通过胎盘屏障和血脑屏障损害中枢神经系统^[1]。环境中BPA暴露可对孕妇妊娠结局及其胎儿发育构成威胁^[2]，近年来对BPA的研究主要集中在生殖和内分泌系统的不良影响方面。随着对BPA研究的深入，BPA对中枢神经系统的影响受到关注。BPA具有雌激素样活性，是一种典型的外源性雌激素，很容易干扰脑内雌激素的活动而影响神经行为的发育^[3]。但BPA的神经毒性作用机制尚不十分清楚。雌激素与雌激素受体（estrogen receptor，ER）结合发挥重要的神经调控作用^[4]，本研究采取孕期和哺乳期母鼠暴露于低或高剂量BPA实验，之后检测子代雄鼠的学习记忆能力及海马ERα蛋白表达，探讨BPA的神经毒性及其作用机制，为进一步研究其有效的防治措施提供参考。

1 材料与方法 1.1 试剂和仪器

BPA（色谱纯，美国Sigma公司），无水乙醇（分析纯，中国北京化工厂），Morris水迷宫记录仪（荷兰Noldus Information Technology公司），ERα鼠多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），GAPDH兔多克隆抗体（美国CST公司），辣根过氧化酶山羊二抗（上海爱必信生物科技有限公司），ECL试剂盒（英国GE Healthcare公司）。BPA染毒溶液配制：准确称取适量BPA溶于无水乙醇，分别配制成0.2 g/L和2 g/L的BPA储存液，使用时加入水配制成0.2 mg/L和2 mg/L BPA染毒溶液，去离子水中无水乙醇的终浓度为1%，对照组饮用仅含1%无水乙醇的去离子水。

1.2 小鼠饲养、分组及染毒

购自中国医科大学动物部的清洁级健康C57BL/6雌雄小鼠48只，雌雄各半，体质量18~22 g。适应性喂养1周后，每日晚8时按雌雄性别1:1合笼交配，次日清晨检查雌性小鼠阴栓，查到阴栓雌性小鼠定为妊娠第0天，孕鼠单笼饲养，自由摄食和饮水。将24只孕鼠随机分为3组：对照组（0.1%无水乙醇）、低剂量BPA组（0.2 mg/L）和高剂量BPA组（2 mg/L），每组8只。小鼠从妊娠第6天开始通过饮水方式进行染毒至哺乳期结束。子代雄鼠3周龄断乳后饮用不含BPA的水至4周龄实验结束。

1.3 雄性仔鼠学习和记忆能力检测

雄性仔鼠进行Morris水迷宫实验，水迷宫分为4个象限，在第四象限中央放置一个直径10 cm的平台。小鼠训练期历时5 d，每次60 s，如果小鼠在水中游泳一段时间后爬上平台，并在平台上停留时间超过5 s，则认为小鼠找到平台。在第6天测试时将平台移除，观察并记录60 s内小鼠在平台所在象限的搜索活动。

1.4 雄性仔鼠海马组织ERα蛋白检测

雄性仔鼠处死后取出脑和海马，称量并记录脑质量和海马质量。取雄性仔鼠海马组织置于1.5 mL EP管中，用剪刀将组织块剪碎，在海马组织内加入预冷6倍体积的RIPA裂解液置于冰上进行裂解加入海马组织，超声粉碎3次，4 ℃，12 000 r/min离心20 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度，根据标准品孔浓度及吸光度（optical denssity，OD）值绘制标准曲线，计算各样品中蛋白浓度。蛋白含量半定量时使用8%的浓缩胶，使用100 V、90 min电泳模式，电泳后把胶拿出放入PBST内洗胶，之后进行转膜，后半干转至硝酸纤维素膜上。将膜放入BCA封闭液中封闭2 h后，孵育一抗（ERα多克隆抗体，1:1 000；GAPDH多克隆抗体，1:1 000），4 ℃冰箱过夜。次日，孵育与一抗相对应的二抗（稀释浓度为1:5 000），室温1 h，然后进行ECL化学发光反应，采集图像，并分析各产物OD值，实验结果用各待测样本和相应样本GAPDH的OD值比值（ODx/OD_GAPDH）来表示。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0进行统计分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 BPA暴露对雄性仔鼠脑质量、海马质量的影响

结果显示，与对照组比较，BPA暴露各组雄性仔鼠脑质量、海马质量差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。

2.2 各组雄性仔鼠学习和记忆能力比较

结果显示，在迷宫训练中，各组雄性仔鼠随着训练时间增加搜索平台的距离和时间缩短，说明各组仔鼠都有一定的空间学习和记忆能力。与对照组比较，低剂量BPA组仔鼠搜索平台的距离在第4、5天显著延长，而搜索平台的时间在第5天时显著延长（均P＜0.05）；高剂量BPA组仔鼠搜索平台的距离和时间在第4、5天时均显著延长（均P＜0.05）。见表 2、表 3。在第6天水迷宫测试中，与对照组比较，BPA暴露各组穿过目标象限次数减少和在目标象限的停留时间缩短（均P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组穿过目标象限次数减少和在目标象限的停留时间缩短更加明显（P＜0.05）。见图 1、表 4。

2.3 各组雄性仔鼠海马中ERα蛋白表达比较

结果显示，对照组、低剂量BPA组、高剂量BPA组海马中ERα蛋白表达分别为1.17±0.35、0.64±0.21、0.40±0.12，与对照组比较，BPA暴露各组ERα蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）；与低剂量BPA组比较，高剂量BPA组ERα蛋白表达水平降低更加明显（P＜0.05）。见图 2。

3 讨论

BPA具有模拟雌激素和拮抗雄激素的作用，最近流行病学研究^[5]显示，BPA也与代谢性疾病（肥胖和糖尿病）以及心血管疾病有关。越来越多的研究^[6]证明包括BPA在内的环境内分泌干扰物都可能导致神经发育障碍。美国国家毒理学项目（national toxicology program，NTP）研究^[7]也指出BPA对胎儿、婴儿和儿童的脑和行为都会产生不同程度的影响。因此，神经系统被认为是BPA的重要作用靶点。目前有关BPA对神经行为的研究报道较少，而且BPA作用的分子机制还不清楚。

本研究中低剂量（0.2 mg/L）BPA是根据美国FDA报道的BPA每天允许暴露限量（50 μg/kg）进行设计的^[8]。在本研究的水迷宫实验中，孕期和哺乳期BPA暴露使低、高剂量BPA组雄性仔鼠每天到达平台的平均距离和潜伏期表现出随时间减少的趋势，说明低、高剂量BPA组雄性仔鼠都有一定的空间学习和记忆能力，但显著低于对照组（P＜0.05），表现出对目标平台记忆不清晰，提示孕期和哺乳期BPA暴露导致雄性仔鼠产生了空间学习功能的障碍。

结果显示，低、高剂量BPA组雄性仔鼠穿过目的象限的次数和停留的时间显著少于对照组（P＜0.05），高剂量BPA组雄性仔鼠穿过目的象限的次数和停留的时间也显著少于低剂量BPA组（P＜0.05），提示孕期和哺乳期BPA暴露导致雄性仔鼠产生空间记忆功能的障碍，且出现剂量-效应关系，进一步提示相对于空间学习功能的障碍，雄性仔鼠空间记忆功能的损伤更严重。

有研究^[9]发现，C57BL/6雄鼠灌胃BPA暴露（20 mg·kg^-1·d^-1）2周，对小鼠的空间学习和记忆功能产生损伤；还有研究^[10]发现母鼠孕期暴露BPA（50 mg·kg^-1·d^-1）可损伤仔鼠的水迷宫和被动逃避行为，该行为损伤可持续到仔鼠成年后。这可能是由于发育期接触BPA，不仅影响脑内雌激素合成关键酶芳香化酶的活性和表达，还可改变不同脑区ERα的表达，并因此放大或干扰雌激素对行为发育的调节作用^[11]。此外，研究^[11]也发现发育期大鼠BPA暴露（0.25 mg·kg^-1·d^-1）可明显降低学习功能，本研究使用的BPA剂量明显低于上述研究，同样出现了学习和记忆功能的损伤。因此，BPA的神经毒性作用的最低剂量及时间等问题还需要进一步研究。

ER可介导雌激素参与学习、记忆、认知等神经功能的调节功能，包括经典的核内受体和细胞膜表面受体，分别介导雌激素经典基因组机制和非基因组作用机制，参与学习、记忆、认知等神经功能的保护^[12-13]。研究^[14]发现，BPA暴露仅改变海马ER信号中ERα的表达而非ERβ的表达。本研究结果显示，BPA暴露各组致雄性仔鼠学习和记忆能力受损的同时，海马组织内ERα蛋白表达下降，而且高剂量BPA暴露使ERα蛋白下降更加明显，说明孕期和哺乳期BPA暴露导致雄性仔鼠学习和记忆能力障碍，可能与海马内ERα表达降低有关。

研究^[15]表明，在培养的海马神经元中，BPA暴露可导致ERα mRNA的表达下降，但ERβ mRNA没有影响。然而，也有研究^[16]报道孕期BPA暴露（2、200 mg·kg^-1·d^-1）都没能引起雌雄子鼠海马区域ERα基因的表达发生显著改变。这一研究结果与本研究不同，可能是由于暴露时间（孕期）和本研究存在差异。已有研究^[17]表明海马ERα的表达在子鼠出生后1周出现明显的性别差异。在大鼠中ERα的表达在出生后第4天出现峰值，随后缓慢下降至成年期水平^[18]。这种动态的表达特征表明早期BPA暴露下调ERα的影响有可能会推迟ERα在发育早期海马中的表达，进而引起不同暴露时期ERα的表达变化不同。

综上所述，孕期和哺乳期BPA（0.2 mg/L）暴露能够损伤雄性仔鼠的空间学习和记忆能力，且不同行为的敏感性不同，对空间记忆功能的损伤更明显。并且BPA剂量增加对子代小鼠学习记忆损伤更加严重，这可能与BPA致海马内ERα蛋白表达下降有关。