中国医科大学学报  2018, Vol. 47 Issue (8): 682-686

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岳媛, 范秋灵, 都姝妍, 远方, 徐莉, 李琳, 刘楠, 姜奕, 王力宁
YUE Yuan, FAN Qiuling, DU Shuyan, YUAN Fang, XU Li, LI Lin, LIU Nan, JIANG Yi, WANG Lining
乌索酸对高糖诱导人系膜细胞损伤的作用
Effects of Ursolic Acid on High Glucose-induced Injury in Human Mesangial Cells
中国医科大学学报, 2018, 47(8): 682-686
Journal of China Medical University, 2018, 47(8): 682-686

文章历史

收稿日期:2018-01-17
网络出版时间:2018-07-12 10:39
乌索酸对高糖诱导人系膜细胞损伤的作用
岳媛1,2 , 范秋灵1 , 都姝妍3 , 远方2 , 徐莉1 , 李琳1 , 刘楠3 , 姜奕3 , 王力宁1     
1. 中国医科大学附属第一医院肾内科, 沈阳 110001;
2. 辽宁中医药大学附属医院肾内科, 沈阳 110032;
3. 中国医科大学附属第一医院中心实验室, 沈阳 110001
摘要目的 探讨乌索酸(UA)对高糖诱导人系膜细胞损伤的保护作用。方法 人系膜细胞复苏后,用MCM 4201完全培养基常规培养,置于37℃、饱和湿度5% CO2的孵箱内贴壁传代培养,隔天换液1次,取5~9代对数生长期细胞,分为正常糖组(5.5mmol·L-1葡萄糖),高糖组(30.0 mmol·L-1葡萄糖),高渗对照组(5.5 mmol·L-1葡萄糖+24.5 mmol·L-1甘露醇),乌索酸治疗A、B、C组(30.0 mmol·L-1葡萄糖,A、B、C组分别给予0.5、1.0、2.0 μmol·L-1乌索酸)。6组均给药48 h。利用MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测系膜细胞凋亡,采用实时PCR及Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-xLBaxsurvivin mRNA及蛋白表达,细胞损伤相关蛋白TGF-β1FN mRNA及蛋白表达。结果 0.5 μmol·L-1乌索酸治疗组与正常糖组、高渗对照组系膜细胞增殖程度差异无统计学意义(P > 0.05),2.0 μmol·L-1乌索酸治疗组大部分系膜细胞已经死亡。1.0 μmol·L-1乌索酸组抑制高糖诱导的系膜细胞增殖和TGF-β1FNBcl-xlsurvivin mRNA及蛋白表达,增强促凋亡基因Bax mRNA及蛋白表达,促进系膜细凋亡。结论 乌索酸通过促进系膜细胞早期凋亡抑制系膜细胞增殖,抑制TGF-β1表达和FN聚集,减轻系膜细胞损伤。
关键词人系膜细胞    高糖    乌索酸    细胞凋亡    
Effects of Ursolic Acid on High Glucose-induced Injury in Human Mesangial Cells
1. Department of Nephrology, The First Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China;
2. Department of Nephrology, The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, China;
3. Central Laboratory, The First Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China
Abstract: Objective To investigate the effect of ursolic acid(UA) on apoptosis in human renal mesangial cells(RMCs) cultured in a high-glucose medium. Methods After the recovery of RMCs cultured in MCM 4201 medium at 37℃ and 5% CO2, with media being replenished every alternate day, 5-9 generations of cells in the logarithmic phase of growth were selected and divided into a normal glucose group(5.5 mmol·L-1 glucose), high glucose group(30.0 mmol·L-1 glucose), high osmotic group(5.5 mmol·L-1 glucose +24.5 mmol·L-1 mannitol), and treatment A group (30.0 mmol·L-1 glucose+0.5 μmol·L-1 ursolic acid), treatment B group (30.0 mmol·L-1glucose+1.0 μmol·L-1 ursolic acid), treatment C group(30.0 mmol·L-1 glucose+2.0 μmol·L-1 ursolic acid). After 48 h of culturing, RMC proliferation was assessed using an MTT assay; apoptosis was assessed via Annexin V-FITC double staining flow cytometry. The expression of Bcl-xl, Bax, survivin, TGF-β1, and FN proteins and mRNA were analyzed via Western blotting and RT-PCR, respectively. Results UA at 1.0 μmol·L-1 suppressed RMC proliferation and TGF-β1, FN, Bcl-xl, and survivin mRNA and protein expression induced by HG. UA at 1.0 μmol·L-1 promoted apoptosis in RMCs by upregulating Bax mRNA and protein. Conclusion UA can reduce mesangial cell injury by promoting early apoptosis, inhibiting proliferation, downregulating TGF-β1, and FN aggregation.
Keywords: human mesangial cells    high glucose    ursolic acid    cell apoptosis    

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的严重并发症,是导致终末期肾脏病的最常见原因[1],其发病机制尚未明确,尚无有效药物可以逆转或阻止其进展,已成为世界范围内亟待解决的公共卫生问题。系膜细胞是肾小球固有细胞,也是肾小球内最活跃的细胞,正常情况下无明显增殖,而在病理条件下则出现异常增殖,导致肾小球硬化。机械因素、代谢因素以及多种调节分子(包括某些血管活性物质、细胞因子)等与肾小球硬化的启动及进展密切相关[2],若不给予适当治疗肾小球硬化将进一步加重[3],最终导致终末期肾病。乌索酸(ursolic acid,UA)是一种来源于植物的五环三萜类化合物,广泛存在于浆果、水果及中草药中,具有抗肿瘤、降血糖、降血脂及抗动脉粥样硬化作用[4-6]。本研究探讨UA对高糖状态下系膜细胞凋亡的影响。

1 材料与方法 1.1 试剂和仪器

人肾小球系膜细胞和HMC4201培养基购自美国Sciencell公司;乌索酸(89797)购自美国Sigma公司;MTT粉、AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒购于北京宝赛生物技术有限公司;TrizolRNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司;Go Taqq PCR Master Mix购自美国Promega公司;兔抗Bcl-xl多克隆抗体购自美国Cell Signal Technology;兔抗TGF-β1、FN、Bax、survivin多克隆抗体、兔抗GAPDH多克隆抗体购自美国Proteintech公司;HRP标记羊抗兔IgG购自美国Abcam公司。Power Wave XS2全波长酶标仪(美国Bio-Tek公司)、FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)、Mini Trans-blot电转膜系统(美国Bio-Blot公司)、相差倒置显微镜(日本Olympus公司)、Rotor-Gene 3000 PCR仪(美国Agilent公司)。

1.2 细胞培养

人系膜细胞复苏后,接种于培养瓶中,用MCM 4201完全培养基常规培养,置于37 ℃、饱和湿度5% CO2的孵箱内贴壁传代培养,隔天换液1次,取5~9代对数生长期细胞,消化后制成单细胞悬液,分为正常糖组、高糖组、高渗对照组、UA治疗A、B、C组。正常糖组5.5 mmol·L-1葡萄糖培养;高糖组30.0 mmol·L-1葡萄糖培养;高渗对照组5.5 mmol·L-1葡萄糖+24.5 mmol·L-1甘露醇培养;UA治疗A、B、C组分别30.0 mmol·L-1葡萄糖+0.5、1.0、2.0 μmol·L-1 UA培养。6组均培养48 h后收集细胞。

1.3 方法

1.3.1 MTT法检测细胞增殖

收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入150 μL培养液,铺板,5%CO2,37 ℃孵育至细胞单层铺满孔底(96孔板),每孔加入刺激因素150 μL,分别孵育24 h、48 h后镜下观察。每孔加入20 μL 0.5%MTT溶液培养4 h后加入150 μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解,于570 nm处用酶联免疫检测仪测量各孔光密度(OD)值,计算细胞增殖率。

1.3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡

采用Annexin-V/PI双染法。收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每瓶加入5 mL培养液,调细胞密度至5×105/瓶。5% CO2,37 ℃孵育至细胞贴壁,换含有不同刺激因素的培养液,孵育48 h后每孔加600 μL胰蛋白酶消化,离心5 min后弃上清液,加入缓冲液(500 μL)悬浮细胞并移入流式管,同时加入PI (5 μL)和AnnexinV-FITC (5 μL)避光反应10 min,经流式细胞仪分析。

1.3.3 实时PCR检测Bcl-xl、survivin、Bax、转化生长因子β1 (transforming growth factor β1,TGF-β1)、纤连蛋白(fibronectin,FN) mRNA水平

按照总RNA提取试剂盒说明书提取各组细胞总NRA,紫外分光光度计测量RNA浓度,逆转录以及扩增反应按试剂盒说明书进行。FN正义链,5'-CCGCCATTAATGAGAGTGAT-3',反义链,5'-AGTTAGTTGCGGCAGGAGAA G-3',长度133bp;TGF-β1正义链,5'-GCCCTGGACACCAACTATTGC-3',反义链,5'-AGGCTCCAAATGT AGGGGCAGG-3',长度161bp;survivin正义链,5'-GCTGGCTTCATCCATCCACTGC-3',反义链,5'-CAATTTTGTTCTTGGCTCT-3',长度220bp;Bcl-xl正义链,5'-CCCAGAAAGGATACAGCTGG-3',反义链,5'-GCGATCCGACTCACCAATAC-3',长度448bp;Bax正义链,5'-GACGAGGATTGCTGATA-3',反义链,5'-CTCAGCCCATATTCTTCCAG-3',长度354bp;β-actin正义链,5'-CCATGTACGTTGCTATCCAGG-3',反义链,5'-TCTCCTTAATGTCACGCACGA-3',长度252 bp;引物由日本Takara公司合成。β-actin作为内参对照基因,实验数据处理用2-ΔΔCT方法进行,计算样本mRNA/β-actin mRNA的比值。

1.3.4 Western blotting检测各组细胞Bcl-xl、survivin、Bax、TGF-β1、FN蛋白表达

收集各组细胞,加入60 µL蛋白裂解液及0.6 µL蛋白酶抑制剂,超声破碎20 min后离心5 min,吸取上清液,BCA法测定蛋白浓度,并调整至5 µg/µL;7.5%、10%、12% SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜2 h,一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗膜加二抗室温孵育2 h,TBST洗膜,滴加ECL发光液后观察。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理,结果以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 UA对系膜细胞增殖的抑制作用

结果显示,24 h各组系膜细胞增殖差异无统计学意义(P > 0.05),48 h高糖组系膜细胞增殖率明显高于正常糖组(P < 0.05);0.5、1.0、2.0 μmol·L-1 UA治疗组系膜细胞的增殖率呈剂量依赖性下降,1.0 μmol·L-1 UA治疗组系膜细胞增殖率明显低于高糖组(P < 0.05),细胞生长状态良好;2.0 μmol·L-1 UA治疗组大部分系膜细胞已经死亡,增殖率明显低于高糖组(P < 0.05)。高渗对照组与正常糖组及0.5 μmol·L-1 UA治疗组系膜细胞增殖率无统计学差异(P > 0.05)。提示1.0 μmol·L-1 UA能明显抑制高糖诱导的系膜细胞增殖且细胞状态良好,可作为后续试验的最佳治疗剂量。见表 1

表 1 UA对系膜细胞增殖的影响(x±s,×10-1) Tab.1 Effect of ursolic acid on mesangial cell proliferation (x±s, ×10-1)
Group Proliferation of mesangial cells
24 h 48 h
Normal glucose group 2.66±0.04 3.66±0.32
High glucose group 2.70±0.02 4.33±0.231)
High osmotic group 2.61±0.02 3.50±0.22
0.5 μmol·L-1 ursolic acid group 2.69±0.03 3.93±0.11
1.0 μmol·L-1 ursolic acid group 2.66±0.02 3.59±0.062)
2.0 μmol·L-1 ursolic acid group 1.69±0.062) 0.67±0.162)
1) P < 0.05 compared with normal glucose group;2) P < 0.05 compared with high glucose group.

2.2 UA对系膜细胞凋亡的影响

48 h各组系膜细胞凋亡率如图 1所示。正常糖组、高糖组、高渗对照组、UA治疗组凋亡率分别为(12.21±0.51) %、(12.98±0.27) %、(15.04±0.33) %、(23.02±0.45) %。高糖组与正常糖组比较差异无统计学意义(P > 0.05),而UA治疗组系膜细胞凋亡率显著高于高糖组(P < 0.05)。提示UA促进系膜细胞凋亡,抑制系膜细胞增殖。

A, normal glucose group; B, high osmotic group; C, high glucose group; D, ursolic acid group. NC, normal control; HG, high glucese; UA, ursolic acid. 图 1 流式细胞仪分析UA对系膜细胞凋亡的影响 Fig.1 Flow cytometry was performed to analyze the effect of ursolic acid on apoptosis in mesangial cells

2.3 UA对系膜细胞FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin、Bax表达的影响

结果显示,与正常糖组比较,高糖组FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin表达明显增高(P < 0.05),Bax的表达无明显变化;与高糖组比较,UA治疗组FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin表达明显降低(P < 0.05),Bax表达明显增高(P < 0.05)。见图 23

A, FN mRNA expression; B, TGF-β1 mRNA expression; C, Bcl-xl mRNA expression; D, survivin mRNA expression; E, Bax mRNA expression. # P < 0.05 compared with NG group; * P < 0.05 compared with HG group. NG, normal glucose; HG, high glucose; UA, ursolic acid; mannitol, high osmotic. 图 2 各组系膜细胞FNTGF-β1Bcl-xlsurvivinBax mRNA的表达 Fig.2 Effects of ursolic acid on the expression of FN, TGF-β1, Bcl-xl, survivin, and Bax mRNA in mesangial cells

A,FN protein expression;B,TGF-β1 protein expression;C,Bcl-xl protein expression;D,survivin protein expression;E,Bax protein expression. # P < 0.05 compared with NG group;* P < 0.05 compared with HG group. NG,normal glucose;HG,high glucose;UA,ursolic acid;mannitol,high osmotic. 图 3 各组系膜细胞FN、TGF-β1、Bcl-xl、survivin、Bax蛋白的表达 Fig.3 Effects of ursolic acid on the expression of FN,TGF-β1,Bcl-xl,survivin,and Bax proteins in mesangial cells

3 讨论

DN是糖尿病最重要的并发症,同时也是一个连续的病理变化过程,早期阶段包括系膜细胞增殖、肾小球肥大、基底膜增厚及细胞外基质蛋白聚集,晚期阶段为肾小球硬化及间质纤维化,最终导致肾脏功能的丧失[7-10],细胞外基质蛋白(FN)、Ⅳ型胶原的过多沉积是DN肾脏进展性纤维化的病理基础。前期研究[7]发现高糖刺激人系膜细胞48 h,系膜细胞明显增殖,伴有细胞因子(TGF-β1)、细胞外基质蛋白(FN)的表达增强,提示高糖介导了系膜细胞的增殖与细胞外基质聚集,诱导系膜细胞损伤。近年研究[11-12]提示在DN早期细胞凋亡有利于清除过多的增殖细胞,延缓DN进程。

既往研究[13-14]发现UA诱导Bax/Bcl-2途径使线粒体释放细胞色素C (cytochrome C,CytC)诱导肿瘤细胞凋亡。吴斌等[5]研究发现UA通过抑制AKt磷酸化促进线粒体释放CytC,诱导恶性肿瘤细胞Jurkat凋亡。刘玲等[14]研究发现三萜类化合物(齐墩果酸)可使肝癌细胞Bcl-2表达减少,Bax表达增加,CytC在线粒体中表达降低而在胞质中表达增加,从而抑制肿瘤细胞的生长,诱导细胞凋亡,可能与其影响线粒体功能和能量代谢有关。本研究同样发现UA抑制Bcl-xL表达、促进Bax表达,Bax可与线粒体膜上的电压依赖性阴离子通道蛋白孔道形成复合物,释放CytC,参与并诱导细胞凋亡,缓解细胞损伤。因此UA可能通过促进Bax表达,参与并诱导线粒体释放CytC,启动系膜细胞凋亡,维持系膜细胞正常增殖水平。

综上所述,UA可以诱导系膜细胞早期凋亡,缓解高糖诱导的系膜细胞损伤,为UA对DN的早期治疗提供了新的实验依据。

参考文献
[1]
LIN Y, SUN Z. Thyroid hormone potentiates insulin signaling and attenuates hyperglycemia and insulin resistance in a mouse model of type 2 diabetes[J]. Br J Pharmacol, 2011, 162(3): 597-610. DOI:10.1111/j.1476-5381.2010.01056.x
[2]
范秋灵, 肇晓明, 蒲实, 等. 坎地沙坦不同治疗时机对2型糖尿病KK/Ta小鼠肾脏晚期糖基化终末产物形成及其受体表达的影响[J]. 中国医师杂志, 2012, 14(2): 145-150. DOI:10.3760/cma.j.issn.1008-1372.2012.02.001
[3]
NOKI K. Role of mitogen-activated protein kinases as downstream effectors of transforming growth factor-beta in mesangial cell[J]. Kidney Int Suppl, 2000, 77(9): 76-80.
[4]
LIN J, LIN Y, SU L, et al. The role of Jagged1/Notch pathway-mediated angiogenesis of hepatocarcinoma cells in vitro, and the effects of the spleen-invigorating and blood stasis-removing recipe[J]. Oncol Lett, 2017, 14(3): 3616-3622. DOI:10.3892/ol.2017.6611
[5]
吴斌, 汪旭, 王慧涵, 等. 乌索酸诱导Jurkat细胞凋亡及其机制的初步研究[J]. 中国实验血液学杂志, 2010, 18(1): 61-66.
[6]
王琳, 王冠梁, 刘甲寒, 等. 熊果酸通过过氧化物酶增殖受体α和γ信号通路改善KKAy小鼠肝脏胰岛素抵抗的机制[J]. 中西医结合学报, 2012, 10(7): 793-799.
[7]
LU X, FAN QL, XU L, et al. Ursolic acid attenuates diabetic mesangial cell injury through the up-regulation of autophagy via miRNA-21/PTEN/Akt/mTOR suppression[J]. PLoS One, 2015, 10(2): e0117400. DOI:10.1371/journal.pone.0117400
[8]
ZHENG F, GUAN Y. Thiazolidinediones:a novel class of drugs forthe prevention of diabetic nephropathy?[J]. Kidney Int, 2007, 72(11): 1301-1303. DOI:10.1038/sj.ki.5002557
[9]
薛记莲, 郑艺花, 邹贵勉, 等. 肾小球系膜细胞及其相关疾病[J]. 中国中西医结合肾病杂志, 2013, 14(10): 930-932.
[10]
林志民, 李月婷, 郑兴中, 等. 熊果酸含药血清对大鼠肾小球系膜细胞增殖及TGF-β1表达的影响[J]. 中国医院药学杂志, 2017, 37(10): 938-941. DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2017.10.10
[11]
MENINI S, IACOBINI C, ODDI G, et al. Increased glomerular cell (podocyte) apoptosis in rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus:role in the development of diabetic glomerular disease[J]. Diabetologia, 2007, 50(12): 2591-2599. DOI:10.1007/s00125-007-0821-y
[12]
KIM KH, SEO HS, CHOI HS, et al. Induction of apoptotic cell death by ursolic acid through mitochondrial death pathway and extrinsic death receptor pathway in MDA-MB-231 cells[J]. Arch Pharm Res, 2011, 34(8): 1363-1372. DOI:10.1007/s12272-011-0817-5
[13]
吴计超, 祝杰, 聂东雷, 等. 钩藤中乌索酸和钩藤碱对肝癌细胞株HepG2的影响[J]. 中国中医药信息杂志, 2017, 24(5): 63-66. DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.015
[14]
刘玲, 黄紫乐. 齐墩果酸经线粒体损伤诱导SMMC-7721细胞凋亡的作用[J]. 中国临床药理学杂志, 2017, 33(2): 144-148. DOI:10.13699/j.cnki.1001-6821.2017.02.013