骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）是具有多种分化潜能的细胞，在成人的骨骼中，BMMSCs主要向成骨细胞和脂肪细胞分化，两者的比例对调控骨组织重建与代谢有重要作用^[1]。Wnt信号通路在牙发育和骨形成过程中作用显著^[2-3]。活化的经典Wnt通路通过上调成骨分化相关基因Runx2、Dlx5、Osterix和ALP促进BMMSCs向成骨分化^[4]。可见Wnt信号通路与许多骨疾病密切相关，并参与BMMSCs分化方向的调控，但在Wnt信号通路中关键基因调控BMMSCs的分化方向及变化趋势尚未见文献报道。因此本研究探究Wnt3a蛋白对BMMSCs不同时间点成骨分化的影响，以及与Wnt/β-catenin信号通路调控的关系，以期为Wnt3a诱导的BMMSCs在骨修复中的应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

BMMSCs购自北纳创联生物技术有限公司；DMEM/F12购自美国Hyclone公司；胎牛血清FBS购自美国SerePro公司；BMMSCs成骨诱导液购自美国Cyagen公司；细胞RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；RNA逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司；引物由大连宝生物有限公司合成；Wnt3a蛋白购自美国Absci公司。

1.2 实验分组

实验分为诱导对照组和Wnt3a蛋白诱导组，诱导对照组：成骨诱导培养基（地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、10%FBS、1%双抗），Wnt3a蛋白诱导组：成骨诱导培养基（地塞米松、β甘油磷酸钠、维生素C、10%FBS、1%双抗）和10 ng/mL Wnt3a蛋白。2组分别在诱导后的第1、5、10、15和20天于显微镜下观察细胞形态、染色、RNA提取及蛋白提取。

1.3 BMMSCs成骨诱导培养

将冻存的BMMSCs从液氮罐中取出，置于37 ℃水浴锅内，摇动使其融化。将细胞悬液移入加有适量培养液的离心管中离心，弃上清后加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、10%FBS、1%双抗和10 ng/mLWnt3a蛋白的成骨培养基，37 ℃，5%CO₂培养。每2~3 d换液1次，显微镜下观察细胞状态，待细胞密度达70%~80%时进行传代培养。

1.4 茜素红染色

选择生长状态良好的BMMSCs，用0.05%胰蛋白酶消化，接种于6孔板中，加入上述已配好的成骨诱导培养基，于诱导第1、5、10、15和20天显微镜下观察细胞形态及生长变化情况，应用10%中性甲醛固定30 min后，PBS冲洗，加入茜素红染液染色。显微镜下观察成骨染色效果。

1.5 实时PCR检测RUNX2、β-catenin及BSP mRNA

提取总RNA，反转录合成cDNA，操作按照产品说明书进行。实时PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；55 ℃ 30 s 80个循环，绘制熔解曲线。RUNX2引物序列为F 5’-AGGGGCTGTGG AGTTTGGT-3’，R 5’-TGACTTTTCGGGGAGGAGA G-3’；β-catenin引物序列为F 5’-GCCAG TGGATTCC GTACTG-3’，R 5’-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG- 3’；BSP引物序列为F 5’-GCGTGCTTCTTAGACGGACT G-3’，R 5’-CGTCAGAGGGCTGGGATG-3’；GAPDH引物序列为F 5’-TGCACCACCAACTGCTTAG-3，R 5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3。采用2^-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。

1.6 Western blotting检测蛋白表达

用蛋白裂解液提取细胞蛋白，BCA法做蛋白定量，取已制备样品10 μL进行SDS-PAGE电泳。120 V转膜2 h，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加1:1 000 Runx2/ 1:1 000 β-catenin/1:1 000 BSP/1:5 000 actin一抗，4 ℃过夜。加1:10 000 HRP IgG二抗，室温孵育1 h。ECL显影，用Scion Image 4. 03软件分析。

1.7 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件One-Way ANOVA分析实验数据。实验结果以x±s表示，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 细胞形态

光学显微镜下观察BMMSCs不同生长阶段形态学，Wnt3a蛋白诱导组第1天可见细胞呈小圆形、散在分布，随着时间的延长细胞分化明显，至第10天细胞呈纺锤形，偶呈扁平状和多角形，有小集落形成，呈不规则短梭，至第20天细胞形态基本一致，排列较整齐，呈长梭形成纤维样，漩涡状生长，见图 1。诱导对照组细胞较Wnt3a蛋白诱导组，在各个时间点分化程度明显减弱。

2.2 茜素红染色

茜素红染色镜下显示，BMMSCs向成骨诱导分化的过程，部分细胞逐渐聚集一起呈“集落状”生长，形成矿化结节，在诱导第5天后茜素红染色可见密集的散在的橘红色矿化结节。与诱导对照组相比，Wnt3a蛋白诱导组各时间点可见较多的橘红色矿化结节。见图 2。

2.3 RUNX2、β-catenin及BSP mRNA表达水平

研究结果表明，诱导对照组和Wnt3a蛋白诱导组BMMSCs成骨过程中，RUNX2、β-catenin及BSP mRNA有不同水平的增加，均在第10天达到峰值。Wnt3a蛋白诱导组RUNX2、β-catenin及BSP mRNA表达水平在各个时间点均明显高于诱导对照组（P < 0.05）。诱导对照组RUNX2、β-catenin及BSP mRNA表达在诱导后第1、5、10天有明显上升趋势（P < 0.05），随后在第15、20天呈下降趋势，但下降幅度无统计学意义（P > 0.05）。见图 3。

2.4 RUNX2、β-catenin及BSP蛋白表达情况

诱导对照组和Wnt3a蛋白诱导组BMMSCs成骨过程中，RUNX2、β-catenin及BSP蛋白表达有不同水平的增加，均在第10天达到峰值。Wnt3a蛋白诱导组RUNX2、β-catenin蛋白表达水平在诱导后的第5、10、15和20天明显高于诱导对照组（P < 0.05），BSP蛋白表达在各个时间点均明显高于诱导对照组（P < 0.05）。诱导对照组RUNX2、β-catenin及BSP表达在诱导后第1、5、10天有明显上升趋势（P < 0.05），随后小幅下降（P > 0.05）。见图 4、5。

3 讨论

BMMSCs具有自我克隆增殖，并能向成脂细胞、成骨细胞、神经细胞等分化的能力，体外通过不同的诱导方法使BMMSCs分化成软骨、成骨细胞等用于多种疾病的治疗，被称为“种子细胞”^[5]。Wnt信号通路是近年来研究细胞生物学行为的新热点，激活经典Wnt/β-catenin信号能够促进干细胞骨向分化、自我更新及抑制凋亡等机制增加骨组织的再生^[6]。但是，BOLAND等^[7]报道Wnt/β-catenin信号通路中一些蛋白信号的过度增强反而会诱导BMMSCs衰老。Wnt3a是Wnt蛋白家族一员，主要通过旁分泌、自分泌方式释放于胞外，并结合细胞表面受体，激活下游信号产生级联效应^[8-9]。本研究采用小剂量Wnt3a蛋白对BMMSCs进行干预，观察Wnt3a在不同分化时间点对BMMSCs成骨分化的调控作用，探索经典Wnt/β-catenin信号通道对于BMMSCs成骨分化的调节机制。

本研究中，茜素红染色结果显示，BMMSCs在体外培养的环境下，进入干细胞定向期，启动向成骨细胞的分化。通过成骨诱导液（地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油钠）联合Wnt3a蛋白，诱导干细胞进入细胞外基质沉积期。本研究诱导5 d后，Wnt3a蛋白诱导组与诱导正常组比较，前者向成骨细胞诱导分化的干细胞中Wnt信号通路关键信号转导因子β-catenin和成骨相关蛋白RUNX2、BSP表达明显升高，表达高峰出现在第10天，之后有轻度下降趋势。提示Wnt3a蛋白通过活化Wnt信号通路进而调节转导因子和成骨相关蛋白水平。周大凯等^[10]研究发现，高表达Runx2可上调成骨相关基因、BMP-2、OCN、ALP基因和蛋白的表达水平，进而促进脐血间充质干细胞成骨分化。涂艳等^[11]发现淫羊藿苷可以提高β-catenin和Runx2的蛋白表达水平，激活Wnt/β-catenin信号通路，参与并调控BMMSC的成骨分化。本研究结果显示，Wnt3a可能通过Wnt/β-catenin信号途径促进BMMSCs成骨分化，且在成骨诱导的早期刺激效果最佳，在成骨诱导的后期，Wnt3a蛋白对成骨诱导效果减弱。这说明经典Wnt信号通路对骨分化的调节作用依细胞分化程度的不同而不同。一旦BMMSCs启动向成骨分化的方向，Wnt信号通路促进干细胞向成骨分化，即细胞形态由梭形转变成多角形；RUNX2、BSP等成骨特定基因高表达；ALP特异性蛋白的表达；矿化结节的出现。而CHO等^[13]和DE BOER等^[14]报道高水平Wnt3a表达能减缓正在发生骨生成BMMSCs的基质钙化进程和降低ALP活性，抑制地塞米松诱导BMMSCs的成骨发生。可见Wnt3a对BMMSCs成骨分化的调控作用与Wnt3a剂量有直接关系。

综上所述，BMMSCs的体外成骨受Wnt/β-catenin信号通路调控，并受细胞分化阶段的影响，在BMMSCs进入分化阶段后，Wnt3a所介导的Wnt信号通路促进BMMSCs向成骨分化，但在成骨细胞发育晚期，Wnt3a介导的Wnt信号通路对BMMSCs作用由促进变为抑制成骨细胞，最终发育成熟。