肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种常见的恶性肿瘤，病死率高^[1]，临床上具有起病隐匿、早期即发生侵袭和转移的特点，侵袭和转移是HCC患者致死的重要原因。因此研究HCC侵袭和转移的机制，探寻新的抗侵袭和转移方法对于改善患者临床疗效具有重要意义。葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）在恶性肿瘤细胞中过表达，而在正常细胞中低表达甚至不表达^[2]。随着对GRP78功能认识的不断深入，研究^[3-4]发现GRP78除了驻留在内质网中发挥分子伴侣作用外，还可以分布在细胞质、细胞膜上，在肿瘤侵袭、转移和耐药性形成中发挥关键的调节作用。近年研究^[5]发现GRP78还可以被肺癌等肿瘤细胞分泌到细胞外，肿瘤细胞分泌的GRP78可以促进肿瘤细胞增殖和新生血管形成。前期研究^[6]证实HCC细胞也可以分泌GRP78，HCC分泌的GRP78通过与细胞表面表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）结合，促进肿瘤细胞增殖，降低对索拉非尼敏感性^[7]。本研究应用GRP78原核重组蛋白处理HCC细胞（SMMC7721和PLC5），观察其对肿瘤细胞侵袭的影响，以期为HCC治疗提供新的线索。

1 材料与方法 1.1 材料

HCC细胞（SMMC7721和PLC5）购自中科院细胞库，大肠杆菌GST重组蛋白（GST-GRP78）为本实验室分离和纯化。Cortactin和磷酸化Cortactin Y421抗体购于英国Abcam公司。FAK、磷酸化FAK（Y397）、Src和磷酸化Src（Y416）、EGFR购自美国Cell Signaling公司。TRITC标记的毒伞素购于美国Sigma公司。HRP标记二抗购自中山公司。ECL发光试剂购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养与GST-GRP78处理：SMMC7721和PLC5在含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM（dulbecco’s modified eagle medium）培养基中，37 ℃，5%CO₂环境下培养。2~3 d更换1次培养液。在GST-GRP78处理前血清饥饿3 h，然后用不同浓度GRP78重组蛋白无血清条件下培养24 h。

1.2.2

侵袭实验：应用xCELLigence RTCA DP无标记细胞功能分析系统检测GRP78重组蛋白对肿瘤细胞侵袭能力的影响，操作严格按说明书进行。应用无血清培养液将SMMC7721和PLC5细胞稀释至1×10⁵/mL，接种于16孔Transwell培养板上层，100 μL/孔，加入不同浓度GRP78重组蛋白。下层加入完全培养液，以表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）作为阳性对照，以无血清培养液为阴性对照。在37 ℃，5%CO₂的环境下培养24 h，观察细胞侵袭能力。

1.2.3

免疫荧光及细胞骨架染色：将SMMC7721细胞接种于共聚焦显微镜专用的培养皿中，12 h后加入GRP78重组蛋白处理24 h，PBS漂洗，3.7%甲醛固定30 min，0.2%Triton-X-100透化5 min，1% BSA封闭30 min，一抗（兔源抗Cortactin）温育1 h，FITC标记的羊抗兔IgG和TRITC标记的毒伞素温育30 min，共聚焦显微镜下观察。

1.2.4

免疫印迹实验：将GRP78重组蛋白处理的SMMC7721细胞用放射免疫沉淀测定（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）缓冲液[1% NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、1%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、0.1%苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）]裂解，小牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）法定量，SDS-PAGE电泳，转膜，1% BSA封闭，一抗（1: 1 000稀释）4 ℃杂交过夜，PBST洗膜后加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗室温温育1 h，ECL显色。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，多组比较采用单因素方差分析，2组比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 重组GRP78促进HCC细胞（SMMC7721和PLC5）侵袭

如图 1所示，重组GRP78对SMMC7721和PLC5侵袭能力具有促进作用，随着重组蛋白浓度增加促进作用逐渐增强，400 ng/mL促进作用最明显，呈现浓度依赖性的关系；400 ng/mL处理组与空白对照组（0 ng/mL）比较有统计学差异（P < 0.01）。

2.2 重组GRP78促进侵袭伪足形成

共聚焦显微镜观察抗Cortactin（绿色）和F-actin（红色）共染色结果显示，重组GRP78处理后的SMMC7721和PLC5细胞中黄色荧光斑点明显增加（图 2A、2B），显示重组GRP78可以促进HCC细胞侵袭伪足形成。

SMMC7721细胞中检测重组GRP78对Cortactin磷酸化的影响，结果显示，重组GRP78可以促进Cortactin磷酸化，而对其表达没有影响。见图 3A。

2.3 重组GRP78蛋白促进FAK和Src磷酸化

免疫印迹实验结果显示在重组GRP78处理的SMMC7721中，FAK和Src磷酸化水平明显高于未处理细胞，而在重组GRP78处理细胞和未处理细胞中，FAK和Src的表达没有差异，这提示重组GRP78可以促进FAK和Src的磷酸化，而对其表达没有影响。见图 3B。

2.4 抗体封闭细胞表面EGFR阻断外分泌GRP78介导的HCC侵袭

应用抗-EGFR抗体预处理SMMC7721细胞，封闭细胞表面EGFR。结果发现与未预处理的细胞比较，EGFR抗体预处理细胞经重组GRP78处理后，其侵袭能力明显减弱（P < 0.05）。提示EGFR在重组GRP78促进HCC细胞侵袭过程中具有重要作用。见图 4。

3 讨论

侵袭和转移是HCC患者死亡的重要原因，目前HCC侵袭和转移机制尚不清楚。GRP78是内质网合成的一种分子伴侣，属于热休克蛋白70家族。GRP78在肿瘤细胞过表达，对肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等生物学特性具有重要调节作用^[8]。最近研究^[9]显示GRP78不仅定位在内质网、细胞质和细胞膜，还可以被肿瘤细胞分泌到细胞外。有报道^[10]指出在恶性肿瘤患者血清样品中GRP78含量显著高于非肿瘤患者，可以作为恶性肿瘤诊断的标志物。也有研究^[11]指出，肿瘤细胞外分泌的GRP78可以激活PI3K/Akt信号通路，促进肿瘤细胞增殖。本课题组前期研究^{[6, 12]}表明HCC外分泌的GRP78可以通过激活EGFR/Src/STAT3信号通路，导致HCC细胞对索拉非尼反应性降低。

本研究结果发现GRP78可以明显促进HCC的侵袭。侵袭伪足是肿瘤细胞在侵袭过程中形成的一种特化结构，在肿瘤细胞的侵袭过程中发挥关键作用，本研究显示重组GRP78可以促进侵袭伪足形成，并促进侵袭伪足关键蛋白Cortactin磷酸化。本研究表明重组人GRP78可以促进FAK和Src磷酸化。研究^[13-14]显示FAK-Src信号通路是肿瘤细胞内的重要信号通路，不仅促进肿瘤细胞侵袭，还参与肿瘤细胞增殖、耐药性形成。当该通路被细胞内外信号激活后，FAK第397位酪氨酸磷酸化水平增加，促进Src激酶第416位酪氨酸磷酸化激活Src，促进肿瘤细胞侵袭。本研究应用EGFR单克隆抗体封闭细胞表面EGFR，结果发现重组GRP78对HCC侵袭的促进作用被明显抑制。这提示EGFR在HCC外分泌GRP78促进侵袭过程中也具有重要作用。以往研究^[6]显示外分泌GRP78可以与EGFR结合，导致HCC对索拉非尼耐药。本研究结果显示外分泌GRP78可以促进HCC细胞侵袭。这些进一步说明EGFR可能是抑制HCC侵袭和逆转索拉非尼耐药性的重要靶点。

综上所述，HCC细胞外分泌GRP78可以促进HCC侵袭，EGFR在该过程中可能发挥重要作用，为临床上抑制HCC侵袭和索拉非尼耐药性及HCC治疗提供了新的线索。但本研究为体外研究，尚缺乏动物实验和临床实验的支持，对机制探讨也不够深入。今后的研究将在动物水平进一步探讨外分泌GRP78促进HCC侵袭的效果，并对机制进行深入研究。