中国医科大学学报  2018, Vol. 47 Issue (6): 548-551

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白雪, 宁宏
BAI Xue, NING Hong
PP242对人晶状体上皮细胞凋亡的诱导及凋亡相关蛋白Bax表达的影响
Effect of PP242 on Apoptosis and Expression of the Apoptosis Protein Bax in Human Lens Epithelial Cells
中国医科大学学报, 2018, 47(6): 548-551
Journal of China Medical University, 2018, 47(6): 548-551

文章历史

收稿日期:2017-12-07
网络出版时间:2018-05-23 9:11
PP242对人晶状体上皮细胞凋亡的诱导及凋亡相关蛋白Bax表达的影响
白雪 , 宁宏     
中国医科大学附属第一医院眼科, 沈阳 110001
摘要目的 研究PP242对人晶状体上皮细胞(HLECs)凋亡的诱导及凋亡蛋白Bax表达的影响。方法 用不同浓度PP242处理人晶状体上皮细胞系SRA01/04,分别用浓度为0、250、500、750、1 000 nmol/L的PP242处理HLECs 48 h后,Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率;采用实时定量PCR及Western blotting方法检测Bax的mRNA及蛋白的表达。结果 250、500、750和1 000 nmol/L PP242对人晶状体上皮细胞系SRA01/04作用48 h后,早期凋亡率分别为7.20%±0.36%、13.77%±0.21%、16.31%±0.20%和18.67%±0.49%,与对照组(0 nmol/L)差异有统计学意义(P < 0.05)。Western blotting结果显示,随着PP242浓度的增加,Bax蛋白表达量增加,与对照组(0 nmol/L)比较差异有统计学意义(P < 0.05);实时定量PCR结果显示,Bax mRNA表达量随PP242药物浓度的增加而增加,相对定量mRNA结果分别为2.157±0.125、3.733±0.302、5.596±0.261和7.436±0.167,与对照组(0 nmol/L)比较差异有统计学意义(P < 0.05)。结论 PP242可以诱导HLECs的凋亡,增加其凋亡蛋白Bax的表达。
关键词PP242    人晶状体上皮细胞    Bax    
Effect of PP242 on Apoptosis and Expression of the Apoptosis Protein Bax in Human Lens Epithelial Cells
BAI Xue , NING Hong     
Department of Ophthalmology, The First Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China
Abstract: Objective To study the effect of PP242 on apoptosis and the expression of the apoptosis protein Bax in human lens epithelial cells(HLECs). Methods Immortal HLECs SRA01/04 were cultured and treated with different concentrations(0, 250, 500, 750, or 1 000 nmol/L) of PP242. Forty-eight hours after PP242 treatment, the apoptotic rate of cells in each group was examined with flow cytometry(FCA, Annexin V + PI staining). Using reverse transcription quantitative polymerase chain reaction and Western blotting, the mRNA and protein levels of Bax were examined. Results Forty-eight hours after treatment with 250, 500, 750, or 1 000 nmol/L PP242, the apoptotic rate of HLECs was 7.20%±0.36%, 13.77%±0.21%, 16.31%±0.20%, or 18.67%±0.49%, respectively. Apoptotic rate in the control group was significantly different(P < 0.05) than that in the treatment groups. Results of the Western blotting revealed that the level of Bax was significantly increased. Further, the results of reverse-transcription quantitative PCR showed that expression of Bax mRNA increased in the treatment groups. The relative quantification of Bax mRNA was 2.157±0.125, 3.733±0.302, 5.596±0.261, 7.436±0.167. Compared with the control group, the difference was statistically significant(P < 0.05). Conclusion PP242 induces the expression of Bax and promotes apoptosis in cultured HLECs.
Keywords: PP242    human lens epithelial cells    Bax    

后发性白内障(posterior capsule opacification,PCO)是晶体破损或晶体摘除术后,其残余的皮质或上皮细胞在后囊膜上发生的病理变化。研究[1]表明,PCO的发生是由众多生长因子及细胞凋亡共同作用的。所以,现阶段的重心是如何在促进人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLECs)凋亡的同时抑制其增殖。作为新型的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammal target of rapamycin,mTOR)抑制剂PP242,可以影响多种肿瘤细胞的发展[2]。既往的研究[3]已经证明,PP242对HLECs的生长有抑制作用,同时有减弱促凋亡蛋白Bcl-2的作用。本研究用不同浓度PP242处理HLECs,观察PP242对其凋亡的影响及凋亡蛋白Bax的变化,揭示PP242对PCO的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

PP242(美国Sigma公司),人晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞株(中国北京中国科学院肿瘤研究所),胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培养基(美国Hyclone公司),Annexin V-FITC/PI双染流式细胞检测试剂盒(中国碧云天公司),细胞培养耗材(美国Corning公司),兔抗人β-actin单克隆抗体、辣根酶标记的山羊抗兔lgG二抗(美国Santa Cruz公司),兔抗人Bax抗体(美国Abcam公司),β-actin mRNA引物、Bax引物(中国上海生工生物工程有限公司)。

1.2 细胞分组

对照组用含浓度为0 nmol/L PP242的培养基培养细胞;实验组分别用含250、500、750、1 000 nmol/L PP242的培养基培养细胞,培养时间均为48 h。

1.3 Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率

用0.25%胰蛋白酶消化细胞,将制备的单细胞悬液加入15 mL离心管中,4 ℃的PBS洗2次。用250 μL结合缓冲液将细胞悬浮,调整细胞数至1×106/mL,取100 μL放入检测管中,加5 μL Annexin V/-FITC和10 µL PI溶液,混匀、室温避光、孵育15 min。加入400 µL PBS,上流式细胞仪检测。

1.4 Western blotting检测经PP242处理后SRA01/04的Bax蛋白表达情况

将各实验组细胞低温加入裂解液,离心(13 000 r/min、4 ℃)15 min,测蛋白浓度。每孔取50 μL样品行10%SDS-PAGE电泳。转膜,封闭2 h,4 ℃封一抗(兔抗人Bax单克隆抗体)12 h。TBST洗15 min,3次。室温封二抗(辣根酶标记山羊抗小鼠抗体)2 h,TBST洗15 min,3次。用ECL化学发光法曝光胶片。

1.5 实时定量PCR检测经PP242处理后SRA01/04的Bax mRNA表达情况

用异硫氢酸胍-酚-氯仿法提取总RNA,测A260 nm和A280 nm,并计算RNA浓度。取浓度为500 ng/μL RNA 2 μL,逆转录cDNA,行实时定量PCR。β-actin上游引物序列:5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’,下游引物序列:5’-AAAGGG TGTAACGCAACTAA-3’;Bax上游引物序列:5’-CCGATTCATCTACCCTGCTG-3’,下游引物序列:5’- TGAGCAATTCCAGAGGCAGT- 3’。取2 μL cDNA模板,设3个复孔,两步法扩增目的基因,40个循环行PCR反应。计算各组β-actinBax mRNA的相对表达量。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件行统计分析,组间比较采用单因素方差分析,计量资料用x±s表示,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Annexin V/PI双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡率

图 1所示,左下区为Annexin V-FITC和PI均阴性,表示活细胞;左上区为PI阳性,表示死亡细胞;右下区为Annexin V-FITC阳性、PI阴性,表示早期凋亡细胞;右上区为Annexin V-FITC和PI均阳性,表示死亡细胞及中晚期凋亡细胞。各实验组(250、500、750、1 000 nmol/L)早期凋亡率分别为7.20%±0.36%、13.77%±0.21%、16.31%±0.20%和18.67%±0.49%,与对照组(5.93%±0.61%)比较,实验细胞早期凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P < 0.05)。

A, 0 nmol/L; B, 250 nmol/L; C, 500 nmol/L; D, 750 nmol/L; E, 1 000 nmol/L. 图 1 各组HLEC Annexin V+PI双染流式细胞分析散点图 Fig.1 Flow cytometry analysis of apoptosis in HLEC after treatment with PP242

2.2 Western blotting法检测经PP242处理后SRA01/04的Bax蛋白表达情况

图 2所示,实验组Bax蛋白表达水平随PP242浓度的增加而增加。各实验组与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。

1, 0 nmol/L; 2, 250 nmol/L; 3, 500 nmol/L; 4, 750 nmol/L; 5, 1 000 nmol/L. 图 2 免疫印迹法检测经PP242处理后SRA01/04的Bax蛋白表达情况 Fig.2 Immunoblotting for Bax protein expression after treatment of cells with PP242

2.3 实时定量PCR检测经PP242处理后SRA01/04的Bax mRNA表达情况

各实验组(250、500、750、1 000 nmol/L)Bax mRNA相对表达量分别为2.157±0.125,3.733±0.302,5.596± 0.261和7.436±0.167,与对照组比较,差异有统计学意义(P < 0.05)。提示Bax mRNA表达量随PP242浓度的增加而增加。

3 讨论

PCO是晶体摘除术后最常见的并发症[4]。目前公认的发病原因是由于手术中剩余的晶状体上皮细胞上皮-间质转化、晶状体上皮细胞增生和移行造成后囊的皱缩,术后剩余的晶状体上皮细胞移行过程中,形成微小细胞簇,导致了后囊膜的混浊和囊袋的皱缩和变形[3]。由于晶状体手术的改良和人工晶状体的更新,使PCO较前降低。目前治疗PCO的主要方法是后囊膜截开术,但手术局限性高,术后并发症严重(视网膜脱离、黄斑水肿等)[5]。保守治疗PCO已经成为基础研究的重点。多种炎性细胞因子及生长因子可以影响晶状体上皮细胞的凋亡,这跟肿瘤细胞相似。因此,抗肿瘤药物是否可以用于PCO的防治是目前研究的热点。

磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphoinositide3-kinases/protein kinase B/mammal target of rapamycin,PI3K/AKT/mTOR)通路可以影响肿瘤细胞的生长[6]。激活mTOR通路对晶状体上皮细胞有促进增殖诱导凋亡的作用[7]。经典的PI3K/AKT/mTOR通路经典的抑制剂雷帕霉素,仅影响mTORC1即可诱导细胞凋亡[8]。PP242对mTORC1和mTORC2均有影响,可以抑制mTOR的催化活性及其自身磷酸化[9]。因而,PP242诱导凋亡的作用更加显著[10]

细胞凋亡是细胞程序性死亡,由多种基因影响控制[11]。促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白共同存在于细胞内,当凋亡信号发出时,2类蛋白的平衡模式被破坏,促调亡蛋白增多,细胞凋亡[12]。细胞凋亡由多种基因及细胞因子影响,主要有以下2种途径:死亡受体通路和Bcl-2家族介导的线粒体通路[13]。本研究结果表明,进入早期凋亡的细胞比例随PP242浓度的增加而逐渐增加,提示PP242可以诱导HLECs凋亡,并随着浓度增加而增强。

Bcl-2家族介导的线粒体通路在细胞凋亡中作用显著[14]。在线粒体上,Bcl-2家族蛋白通过影响线粒体的稳定性,从而影响细胞凋亡。Bcl-2家族有2种蛋白:一种是以Bax代表的促凋亡蛋白,一种是以Bcl-2为代表的抗凋亡蛋白[15]。Bax主要在线粒体外膜起破坏膜完整性的作用。细胞接到凋亡信号后,Bax增加线粒体膜通透性,促凋亡蛋白及细胞因子进入细胞质,细胞发生凋亡[16]

本研究结果表明,HLECs中Bax蛋白及Bax mRNA的表达随PP242浓度的增加而逐渐增强。因此,PP242使促凋亡基因Bax的表达增高,增加了Bax对HLECs凋亡的促进作用。提示PP242是通过引起Bax的改变来促进HLECs的凋亡,既而表明在PP242诱导的HLECs凋亡过程中有Bcl-2家族介导的线粒体通路的参与。

PP242可以诱导HLECs的凋亡,通过使促凋亡蛋白Bax的表达增加,诱导细胞凋亡,在PP242诱导的HLECs凋亡过程中有Bcl-2家族介导的线粒体通路的参与。然而,在本研究中仅观察到在HLECs凋亡过程中,PP242使促凋亡蛋白Bax表达增加,而在此过程中,PP242是否通过影响其他途径诱导凋亡仍需要更多的研究来证明。

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