虽然周围神经损伤后具有一定的再生潜能，但是一般情况下损伤的周围神经很难实现完全的再生^[1]。周围神经损伤后，施万细胞可以快速地从成髓鞘状态向生长支持的形态转换，损伤的神经远端会有大量的施万细胞增殖，增殖的同时施万细胞会向近端迁移构成基底膜束或者形成Bungner带，一般情况下，在损伤3 d后施万细胞的增殖和转换会达到高峰。施万细胞能够分泌大量的神经营养因子、细胞因子和细胞外基质分子，刺激周围神经再生，促进轴突生长。但因施万细胞自体来源有限，作用时间较短，导致神经损伤难以完全再生^[2-4]。

干细胞是组织工程与再生医学中常用的种子细胞，具有快速自我更新和多向分化的能力。其中，脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）因具有产量高、获取过程损伤小等优势而被广泛应用。研究^[5]发现促有丝分裂和分化因子可以诱导ADSCs向类似施万细胞分化，分化后的细胞能够表达胶质细胞标记物和营养因子受体。但也有研究^[6-7]指出ADSCs很难分化成完全的施万细胞，其旁分泌功能对周围神经再生的作用要远大于分化功能。

本研究将大鼠神经施万细胞用ADSCs条件培养基培养或与ADSCs共培养后，发现ADSCs条件培养基及ADSCs共培养均能促进大鼠神经施万细胞的增殖及分泌功能，为周围神经再生的研究提供了新的思路。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物

4周龄健康成年SD大鼠，体质量90~130 g，用于分离培养ADSCs，由我院实验动物中心提供。本实验获得我院动物伦理委员会审批。

1.1.2 主要试剂

大鼠神经施万细胞（沈阳汇佰生物有限公司）；Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），DMEM培养基（美国Hyclone公司），胰蛋白酶（美国Corning公司），四甲基偶氮唑蓝（北京汇佰生物有限公司），FITC标记的抗大鼠CD31、CD90、CD45和CD44（美国BD公司），神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和GAPDH抗体（美国Santa cruz公司），二抗、ELISA试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），SYBR试剂盒（日本TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs分离培养

用Hanks液清洗SD大鼠双侧腹股沟区脂肪，剪碎脂肪，加入Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化40 min。培养基终止消化后1 000 r/min离心5 min，用培养基重悬细胞，吹打均匀，置37 ℃、5%CO₂培养箱中培养。此后每2~3 d换液1次，待细胞融合至90%时用胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 细胞培养

将大鼠神经施万细胞接种于含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中，置37 ℃、5%CO₂培养箱中培养。

1.2.3 ADSCs表面标记物鉴定

取第三代ADSCs消化离心计数后，用PBS将细胞浓度调节为5×10⁵/mL。取500 μL细胞悬液，分别加入FITC标记的CD31、CD90、CD45和CD44抗体（PBS作为对照），4 ℃孵育30 min，PBS洗1次，PBS重悬细胞，使用流式细胞仪检测。

1.2.4 ADSCs条件培养基获取

待第三代ADSCs在完全培养基中达到90%融合时，更换为含1%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48 h后收集培养液，0.22 μL滤器过滤，获得ADSCs条件培养基。

1.2.5 ADSCs与大鼠神经施万细胞的间接培养

将大鼠神经施万细胞接种于transwell下室中，实验组在transwell上室中接种200 μL浓度为5×10⁵/mL的ADSCs，对照组则不添加ADSCs。

1.2.6 ELISA

按照ELISA试剂盒说明书，使用双抗体夹心法，包被上样，加抗体，底物显色，通过酶标仪分析结果。

1.2.7 MTT实验

将用ADSCs条件培养基培养的大鼠神经施万细胞以1×10⁴/mL浓度接种于96孔培养板中，终体积200 μL，以正常培养基培养的大鼠神经施万细胞作为对照。待细胞贴壁后，于0、12、24、36和48 h（每个浓度、每个时间点分别设3个复孔）分别加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，置37 ℃、5%CO₂培养箱中培养4 h后，弃上清，每孔中加入200 μL DMSO，震荡10 min，在490 nm处记录吸光值。于0、12、24、36和48 h（每个浓度、每个时间点分别设3个复孔）在与ADSCs共培养的大鼠神经施万细胞中加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，置37 ℃、5%CO₂培养箱中培养4 h后，弃上清，每孔中加入200 μL DMSO，震荡10 min，在490 nm处记录吸光值。

1.2.8 Western blotting

细胞培养48 h后使用RIPA裂解液搜集并裂解细胞，提取蛋白，通过G250定量后，取30 μg蛋白进行电泳（80~120V）、转膜（100 V，1 h）后，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入一抗4 ℃过夜后，TBST清洗3次。二抗室温孵育1 h后，TBST清洗3次。ECL发光。

1.2.9 实时PCR

TRIZOL法提取培养48 h的大鼠神经施万细胞RNA，反转录成cDNA，进行实时PCR反应。NGF正向引物序列为5’-ATGTCCATGTTGTTCT AC-3’，反向引物序列为5’-CAGCCTCTTCTTGCAGC C-3’；BDNF正向引物序列为5’-GACCATCCTTTTC CTTAC-3’，反向引物序列为5’-CTATCTTCCCCTTTT AATGG-3’；GDNF正向引物序列为5’-GAACCAAGC CAGTGTATCTCC-3’，反向引物序列为5’-CGTCTCT GCCTTTGTCCTC-3’；VEGF正向引物序列为5’-GAT GAAGCCCTGGAGTGC-3’，反向引物序列为5’-GGT GGTGTGGTGGTGACAT-3’；GAPDH正向引物序列为5’-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3’，反向引物序列为5’-TAGGGCCTCTCTTGCTCAGT-3’。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，用非配对t检验比较2组数据，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 ADSCs细胞鉴定

流式分析结果显示，所提取的细胞CD31阴性（0.38%），CD45阴性（17.53%），CD44阳性（92.31%），CD90阳性（96.42%），证明ADSCs细胞提取培养成功。见图 1。

2.2 ADSCs条件培养基中神经营养因子的检测

通过ELISA检测发现，ADSCs条件培养基中含有大量常见的与神经再生相关的因子，其中，NGF、BDNF、GDNF、VEGF的含量分别为（85.12±1.92）、（184.22±18.32）、（96.97±1.39）、（488.18±4.82）pg/mL，均明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 2。

2.3 ADSCs条件培养基及ADSCs对大鼠神经施万细胞增殖的影响

MTT检测结果显示，ADSCs条件培养基可以明显促进大鼠神经施万细胞增殖（图 3A）；与ADSCs共培养也可促进大鼠神经施万细胞的增殖（图 3B）。

2.4 不同浓度ADSCs对大鼠神经施万细胞中神经营养因子表达的影响

Western blotting与实时PCR结果显示，与对照组相比，使用ADSCs条件培养基培养或与ADSCs共培养的实验组大鼠神经施万细胞中NGF、BDNF、GDNF和VEGF蛋白及mRNA表达水平均增高，差异有统计学意义（均P < 0.05），提示用条件培养基培养或与ADSCs共培养大鼠神经施万细胞能够促进细胞中神经营养因子的表达，见图 4、5。

3 讨论

干细胞能够促进周围神经的再生，但其作用机制目前尚不清楚^[8]。研究^[9-11]表明，骨髓间充质干细胞及ADSCs可以分化为施万细胞，进而在神经修复中发挥重要作用，但也有研究认为干细胞所分化出的施万细胞仅为类施万细胞，仅具有施万细胞的表型，并不能够在体内发挥施万细胞的生理功能。体内实验^[12]证明，骨髓间充质干细胞及ADSCs移植到坐骨神经损伤处后，仅有极小部分能够分化成施万细胞，对整体的神经修复作用不大。目前，大多数研究^[13]认为，在促进周围神经损伤修复中发挥重要作用的是干细胞的旁分泌作用，为了明确ADSCs在外周神经损伤修复中的作用，本研究在获取大鼠ADSCs后，分别将大鼠神经施万细胞用ADSCs条件培养基培养或与ADSCs共培养，并检测了ADSCs对大鼠神经施万细胞的影响。

很多细胞因子能够在周围神经系统中发挥重要作用。周围神经受损后NGF表达上调，可以促进信号的传递以及轴突的生长；周围神经损伤后，BDNF的表达也有一定程度的上升，BDNF可以促进周围神经髓鞘的形成；周围神经受损后，GDNF表达大量增加，促进感觉神经等的再生^[14]；新生血管能够为神经再生提供营养，VEGF的表达可以促进血管的再生，也可以刺激轴突的生长，促进施万细胞的增殖并抑制其凋亡^[15-16]。本研究通过ELISA检测发现ADSCs条件培养基中含有大量的神经营养因子，这些成分都可以促进周围神经的再生，促进大鼠神经施万细胞的增殖。

本研究还发现，ADSCs条件培养基和ADSCs细胞共培养均可促进大鼠神经施万细胞的增殖，并促进该细胞中NGF、BDNF、GDNF和VEGF的表达。提示ADSCs不仅自身能够分泌神经营养因子，还能促进大鼠神经施万细胞增殖并分泌神经营养因子。

综上所述，ADSCs可以分泌大量有利于周围神经再生的生长因子，ADSCs及其条件培养基能促进大鼠神经施万细胞增殖并分泌神经营养因子，从而有助于周围神经的再生。