血痕作为犯罪现场的一种客观存在，包含了极丰富的犯罪信息。通过科学解读现场血痕，总结血痕发现规律，分析血痕形态特征，研究血痕干燥动力学，越来越受到国内外法医学者的重视^[1-4]。而准确的血痕经过时间推断对排查犯罪嫌疑人、缩小和划定侦查范围具有重要意义。目前，法医实践中，现场血痕经过时间推断主要还是一种经验法则的运用，误差较大，相关实验室检测也因为操作复杂，仪器设备昂贵，耗时较长等因素而无法实际应用^[5-6]。本研究利用数字图像分析技术，动态监测血痕数字图像颜色细微变化过程，进而筛选合适参数建立时间推断回归方程，以探索一种现场血痕经过时间简便、快速、无损、客观的推断方法。

1 料与方法 1.1 材料

1.1.1 研究样本

收集20名健康志愿者的肘静脉血。所有志愿者无吸烟史，正常饮食，男女各半，平均年龄为26岁。取血时女性均处于非月经期。抽取静脉血后，立即用移液器分别吸取50 μL血液，于1.0 cm高度垂直滴加在白色纺织物载体上(大连泉兴被服棉纺制品有限公司，100%棉，40S纱)，每名志愿者制作12个血痕样本。

1.1.2 仪器设备

数码相机(佳能5D Mark Ⅳ，3040万像素，分辨率6 720×4 480，日本佳能公司)，多功能痕迹物证照相载物台(ZWT-Ⅱ，中国毕思特公司)。

1.2 方法

1.2.1 样本分组

根据样本放置条件的不同，将样本分为室内组(25~30 ℃，湿度30%~60%，密闭不通风保存)和4 ℃组(冰箱内保存)，室内组又分为黑暗组(暗室内保存)和自然光照组(自然散射光，基本为白天12 h光照，晚上12 h黑暗)。每组80个血痕样本，其中同一志愿者的样本数为4个。

1.2.2 血痕图像采集

在不同血痕经过时间(滴血于纺织物载体后即刻，1~12 h内每间隔0.5 h，> 12~72 h内每间隔1 h，> 72~888 h内每间隔6 h，共221个时间点)，采用数码相机对血痕进行图像采集。采集过程中血痕统一移至暗室环境，在多功能痕迹物证照相载物台上，用垂直固定于距离血痕载体30 cm高度处的数码相机，自动对焦后连续拍摄3次，图像以TIFF格式存储于相机内存卡中。

1.2.3 血痕图像分析

将获得的血痕图像导入计算机，编写相应图像处理程序后，利用MATLAB软件(R2014b，美国Math Works公司)对所获取图像进行分析处理，提取血痕图像中心区7×7个像素区域内红、绿、蓝、青、品红、黄(R、G、B、C、M、Y)6项颜色值，并计算得到各颜色参数的平均值。

1.3 统计学分析

将MATLAB软件提取并输出的数值导入SPSS 22.0软件，对不同环境下6项参数指标数据进行统计学分析，获得6项参数指标实测值，并建立与血痕经过时间的回归方程，进一步通过聚类和判别分析的方式筛选合适参数，以建立多参数血痕经过时间综合推断方程；并对血痕个体内及个体间差异、环境因素对实验结果的影响进行统计学分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 血痕数字图像颜色肉眼观察

不同环境血痕样本颜色均由0 h的鲜红色逐渐变为暗红色，但颜色变化速率在肉眼可分辨时间上有所差异，由快至慢依次为室温自然光照组、室温黑暗组、4℃组。于实验8 h、10 h、12 h内可肉眼观察到差异，之后各组血痕数字图像变化差异肉眼观察难以发现并客观描述。

2.2 数字图像分析

MATILAB软件分析结果显示，随血痕经过时间延长，R(红)、Y(黄)、M(品红)值呈下降趋势，G(绿)和B(蓝)值呈上升趋势，C(青)值变化不明显。在不同温度、不同光照条件下，血痕各参数值总体变化趋势大体一致，但是变化速率有所差异。

2.3 统计学分析

2.3.1 不同环境血痕颜色6项参数指标时间变化规律

将所获得的颜色数据进行统计学处理并分析，得到血痕6项颜色指标(R、G、B、C、Y、M)与血痕经过时间的回归方程。进一步通过聚类和判别分析，建立多参数血痕经过时间综合推断方程(表 1)。

2.3.2 个体内及个体间的6项参数指标与血痕经过时间的相关性

为考量个体差异的影响，本研究从20名志愿者中随机选取4名志愿者，对不同条件下的血痕样本进行统计分析。发现各组Y、M、G值与血痕经过时间相关，且4 ℃组M值与时间的相关程度最高，因此，进一步比较了同一条件下M值与血痕经过时间的变化规律。以4 ℃冰箱环境中纺织物载体上50 μL血痕样本为测试对象，获得同一个体及不同个体间不同血痕经过时间M值的变化趋势(图 1、2)。结果表明，无论同一个体内还是不同个体间，不同血痕经过时间M值变化均呈大致相同的规律，即随时间推移M值呈阶段性变化，480 h内变化迅速，之后变化较平缓。比较相同经过时间的同一个体不同血痕样本的M值，结果无统计学差异(P > 0.05)；比较不同经过时间不同个体的不同血痕样本M值，结果无统计学差异(P > 0.05)。

2.3.3 环境因素对血痕图像颜色变化的影响

为考量环境因素对血痕图像颜色变化的影响，分别对不同温度和光照条件下血痕图像M值变化趋势进行了统计分析，结果发现M值的总体变化规律是一致的，均表现为初始阶段下降较快，之后变化较平缓，但变化的具体时间段不同。室温黑暗环境中表现为480 h内变化迅速；4 ℃冰箱环境中则是560 h内变化迅速，且变化趋势又较室温黑暗环境中略平缓；室温光照环境中则表现为约400 h内下降速度较快，且下降速率较室温黑暗环境中快(图 3)。

3 讨论

本研究采用图像分析技术对血痕颜色细微变化进行实时动态观察，并建立反映血痕颜色特征的6项参数指标与经过时间的对应量效关系，旨在为血痕经过时间推断和命案现场重建提供科学的量化分析指标和可行方法，实现对现场血痕经过时间客观、无损、简便、快速地推断。

瞿勇强等^[2]通过肉眼观察血痕形态变化，发现血痕干涸所形成的龟裂现象对4 h内血痕经过时间推断具有观测价值，但这种方法并不适用于纺织物载体血痕。本研究选择纺织物作为血痕载体，一方面纺织物是生活中极为常见的材料，暴力犯罪案件发生时，常在衣服、床单、窗帘等纺织物上留下血迹；另一方面，由于纺织物具有一定的柔韧性和吸水性，血液在干涸的过程中难以形成其他特征性改变(如干燥、龟裂等)，因此纺织物载体上血痕经过时间的精确推断更显困难。研究^[7]发现，不同环境条件下纺织物血痕肉眼观察及数字图像均随血痕经过时间延长而出现由鲜红色向暗红色转变的颜色变化。分析其原因与血红蛋白衍生物量的变化有关。血红蛋白是血液最主要的组成部分，SHELTON等^[8]研究表明，血痕的颜色取决于氧合血红蛋白、高铁血红蛋白和高铁血色素原3种血红蛋白衍生物的量，血痕中的这3种成分的比例会随着时间的变化而产生变化，且该变化过程是双相的，即在初始阶段所有的氧合血红蛋白发生自氧化生成高铁血红蛋白，然后高铁血红蛋白缓慢降解为高铁血色素原。一旦血液离开人体，所有的去氧血红蛋白都会转化为氧合血红蛋白，因此，血液离体后由鲜红色逐渐变成暗红色^[9]。但随着血痕经过时间的延长，血痕颜色的细微变化肉眼已经无法分辨，只能粗略推断。

目前血痕经过时间的推断方法包括应用RNA分析^[10]、高效能液体光谱^[11]、近红外谱^[12]、紫外可见光谱^[13]、高光谱图像^[14]、傅里叶变换红外光谱和衰减全反射^[15]、单细胞凝胶电泳^[16]等。但上述方法大多局限于实验室操作，检测手段过于复杂，对检验者专业性要求高，需要严格控制检测条件，另外，仪器设备昂贵、操作复杂，且对血痕具有不可逆的破坏性，故而推广性不强，无法实际应用。本研究联合运用RGB及CMY颜色模式计算机图像分析，采用R、G、B、C、Y、M值6项参数指标，在不破坏血痕形态的基础上对血痕数字图像颜色进行量化分析。其原理在于任何图像都是由颜色构成的，色彩学上将描述颜色的方法称为颜色模式或色彩模式^[17]。本研究中经数码相机所采集的血痕图像每个像素点的RGB和CYM值均有所不同，结合MATLAB分析软件的强大功能，可以实现对血痕图像中心区7×7个像素区域6项参数值的提取，并最终取其平均值以减小实验误差。将提取到的图片导入MATLAB，运行程序后直接得出图像R、G、B、C、Y以及M的平均值。研究表明该方法不仅可以快速处理图像，还可以保证图像选取测量区域的特定性，减少极端值的产生。

本研究对形成888 h内的血痕进行连续定点观察，血痕6项颜色指标中，R、Y以及M值3项参数值随经过时间的延长逐渐下降，G、B值随经过时间的延长逐渐增加，而C值的时间规律性不明显。提示血痕颜色随时间延长发生改变的过程反映在数字图像中为不同颜色参数值的增加或减少，是不同颜色参数共同作用的结果。本研究还发现，M值与血痕经过时间相关性最高，与以往的报道^[18]一致。M表示红色和蓝色的互补色，综合表现了R和G的变化趋势，因此M值较其他指标可更全面地体现血痕颜色特征的细微变化。为了使血痕经过时间推断更加准确，本研究综合6项颜色指标的变化特征，应用聚类和判别分析的方法，进一步建立了血痕经过时间推断多参数回归方程。本研究结果显示，相同环境条件下，无论是同一个体还是不同个体间，反映血痕图像颜色的6项参数指标变化规律都是一致的，差异无统计学意义(均P > 0.05)。尽管男性与女性血液中血红蛋白含量存在细微差异^[19]，但本研究中血痕样本血量仅为50 μL，加之血液离体后血红蛋白发生了不可逆的变性，故无论离体前血液最初状态如何，离体后均暴露于外界环境中，转化为氧合血红蛋白的过程是一致的。

本研究发现，处于同一温湿度下的自然光照组与黑暗组血痕的6项参数指标变化趋势虽然一致，但自然光照组较黑暗组血痕变化更快。分析其原因，血痕颜色变化的快慢取决于氧合血红蛋白变为高铁血红蛋白以及从高铁血红蛋白变为高铁血色素原的速度，光照可能升高了载体和周围环境的温度，进而加速了血红蛋白的变性过程，也提示今后在血痕经过时间推断过程中应考虑到光照等对血痕图像颜色变化的影响。本研究结果还表明，与室温光照组和室温黑暗组比较，4 ℃冰箱组血痕颜色变化速度最慢。分析其原因可能是由于血液离体后，细胞色素还原酶b5以及其他可以保持血红蛋白氧合状态的酶发生变性而逐渐失去作用^[20]，然而低温环境下，细胞内酶的活性受到一定抑制，从而延缓了血红蛋白的变性。同时，温度的降低也减缓了血红蛋白逐步变性为高铁血色素原的过程^[9]。

本研究对不同环境下反映血痕数字图像颜色变化的6项参数进行实时动态监测，为现场血痕经过时间推断提供了一种新的、无损的方法和客观量化指标。本研究结果是基于实验室条件下获得的，今后还需要考虑不同地区、不同环境条件、不同种类载体以及更多可能对推断血痕经过时间存在影响的因素，不断扩充血痕经过时间分析系统数据库，以期能更准确地推断血痕经过时间。