1-甲基海因(1-methylhydantoin，1-MH)是五元含氮杂环内源性小分子化合物，化学名1-甲基乙内酰脲。《中国药典》 2015年版一部蛤蟆油项下将其作为鉴别指标^[1]。研究^[2-7]表明1-MH作为乙内酰脲类衍生物具有抗炎、消除活氧自由基、止咳平喘等药理活性。有报道^[8-9]青环海蛇、蟾蜍油和青蛙油中也检测出1-MH，除蛤蟆油外，林蛙的其他部位也含有1-MH ^[10]。目前文献^[11-12]报道多为高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)检测1-MH，为进一步研究具有相似功效动物类中药材与1-MH的关系以及1-MH的生成机制，本研究选取8种不同种属的动物类中药材，在建立气相色谱-质谱法联合测定的基础上研究1-MH的分布状况。

1 料与方法 1.1 仪器与试剂

7890B-5977A气质联用仪(美国Aglient公司)；BT25S分析天平(德国赛多利斯公司)；S25涡旋振荡器(德国IKA公司)；TG16K-Ⅱ高速离心机(长沙东旺实验仪器有限公司)。1-MH(批号20151011)购自上海一研生物科技有限公司，纯度 > 99.5%；普罗地芬(内标，SKF-525A，批号1002181548)购自美国Sigma公司，纯度 > 98.0%，其他试剂均为色谱纯。3批次的蛤蚧、蛤蟆油、乌蛇、海蛇、地龙、全蝎、阿胶、紫河车药材均购自北京同仁堂药店，产地为安徽毫州，经中国医科大学刘俊亭教授鉴定为正品。

1.2 溶液制备

(1) 对照品溶液：精密称取1-MH对照品适量，加甲醇溶液溶解并制成1.0 mg/mL溶液。(2)内标溶液：精密称取内标物SKF-525A对照品适量，加甲醇溶液溶解并制成100.0 ng/μL溶液。(3)供试品溶液：解剖蛤蚧。分别取其头部、脊椎骨、骨骼肌、四肢、皮肤、尾部适量称重，粉碎至粉末状，各取样0.4 g置于具塞试管中，分别加入内标SKF-525A溶液5 μL，加入0.01 mol/L盐酸2 mL，超声提取10 min，用2 mL乙酸乙酯震荡提取3 min，3 500 r/min离心10 min。吸取有机层，用氮气吹干仪吹至100 μL，用微量进样器吸取1 μL进GC-MS分析。乌蛇、海蛇、地龙、全蝎、阿胶、紫河车以及蛤蟆油样品均按上述步骤处理。

1.3 气相色谱-质谱条件

(1) 气相色谱条件：采用HP-5ms(30 m×0.25 mm，0.25 μm)弹性石英毛细管柱。采用程序升温：初始柱温为60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升温至260 ℃，保持15 min，总计运行26 min。进样口温度为265 ℃，不分流进样1 μL。载气为高纯氦气(99.9%)，流速为1.0 mL/min。(2)质谱条件：采用电子离子轰击源(EI源，70 eV)，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，SIM扫描方式，溶剂延迟3 min。

2 结果 2.1 1-MH的图谱认证

气相色谱-质谱法分析以选择离子监测质荷比m/z114色谱图中1-MH的峰面积和质荷比m/z86色谱图中SKF-525A的峰面积进行计算，1-MH保留时间为6.9 min，质荷比m/z114为分子离子峰，质荷比m/z42为酰胺键断裂后的碎片离子峰。均得到了良好的色谱响应，见图 1。

2.2 线性范围与检出限考察

精密吸取对照品储备液适量，并用甲醇稀释成浓度为0.1、1.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL的标准工作溶液，各取1 μL按照“1.3”项下的条件进样分析。以1-MH与内标峰面积之比为纵坐标(y)，以1-MH浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，得回归方程：y= 9.392x+6.689 1(r = 0.999 2)，在0.1~100.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好。将最低浓度点继续稀释进样，按照3倍信噪比计算，检出限为0.01 μg/mL。

2.3 方法精密性与重复性考察

取浓度为10.0 μg/mL的1-MH对照品溶液，连续进样6次，每次进样1 μL，记录1-MH的峰面积，计算相对标准差(relative standard deviation，RSD)为1.1%，表明仪器精密度良好。精密称取同一批哈蟆油样品粉末(约0.4 g，过3号筛)，共6份，分别加入1-MH对照品，制备成质量浓度为10.0 μg/mL的供试品粉末，按照样品处理方法进样分析后得到1-MH峰面积的RSD为2.03 %。

2.4 方法准确性实验

精密称取同一批蛤蟆油样品粉末(约0.4 g，过3号筛)，共9份，分别加入1-MH对照品，制备成质量浓度为1.0、10.0、100.0 μg/mL的供试品粉末，每一质量浓度制备3份，按“1.2”项下方法处理样品，根据测得量和加入量(1.0、10.0、100.0 μg/mL)1-MH计算3个浓度的平均加样回收率分别为95.33%、98.42%、96.70%，RSD分别为0.6%、0.8%和1.4%。

2.5 蛤蚧各组织中1-MH分布

根据蛤蚧解剖特点，各个组织部位相对分明，故分为5个部位分别测定，结果显示，蛤蚧各部位均检测出1-MH成分，和骨骼肌相关的组织含量均 > 1 μg/g，而不含或较少含骨骼肌的组织 < 1 μg/g。蛤蚧尾部1-MH含量超过身体其他部位10倍左右，见表 1。

2.6 动物类中药材1-MH分布

结果显示，蛤蟆油、乌蛇、海蛇和蛤蚧中检测1-MH分别为4.45、2.84、10.43、10.73 μg/g，而地龙、全蝎、阿胶和紫河车样品中未检出1-MH。

3 讨论

抗炎作用、免疫调节、抗氧化和平喘作用是蛤蟆油、乌蛇、海蛇、蛤蚧共有的药理作用^[13-16]，这几种药材均检出了1-MH，与已有实验研究^[2-7]的1-MH抗炎、消除活氧和自由基、止咳平喘等药理活性相符合，推测1-MH可能为这几种中药材共同的药效作用物质之一。

蛤蚧尾部1-MH含量高于蛤蚧身体其他部位，这与传统中医注重使用蛤蚧尾部相吻合。《雷公炮炙论》中记载“凡使蛤蚧，毒在眼，勿伤尾也” ^[17]。《岭表录异》中有文“力在尾，不具者无功” ^[18]。现代中药药理研究^[19]表明无尾蛤蚧与尾全蛤蚧相比功效有所下降，价格也差别很大。

1-MH化学结构与苯妥英类似，在不同pH条件下存在烯醇互变现象，碱性条件下主要以极性较大的内酰亚胺形式存在，不利于有机溶剂提取。且碱性条件下酰胺键易发生水解开环降低提取率，故本实验采用强酸性条件(pH=2)提取，效果良好。

本实验建立了气相色谱-质谱联用方法，能够准确测定动物类中药材中1-MH含量，操作简便，方法检出限、回收率、精密性等技术指标均符合要求。1-MH是多种中药材的共有成分，推测其可能为蛤蚧、乌蛇、海蛇和蛤蟆油的共同药理活性物质之一。本研究探索动物类中药材药理作用物质基础，对国家中药材质量标准化建立具有一定意义，同时为进一步研究动物体内1-MH的生成机制提供参考。