中国医科大学学报  2018, Vol. 47 Issue (5): 394-397

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李忠华, 李慧峰, 李晓蕾
LI Zhonghua, LI Huifeng, LI Xiaolei
瞬时感受器电位香草酸受体3促进胶质瘤U251细胞系增殖和侵袭
Transient Receptor Potential Vanilloid 3 Promotes Proliferation and Invasion in Glioma U251 Cells
中国医科大学学报, 2018, 47(5): 394-397
Journal of China Medical University, 2018, 47(5): 394-397

文章历史

收稿日期:2018-03-14
网络出版时间:2018-04-26 13:36
瞬时感受器电位香草酸受体3促进胶质瘤U251细胞系增殖和侵袭
李忠华1 , 李慧峰2 , 李晓蕾3     
1. 贵州医科大学第三附属医院神经外科, 贵州 都匀 558000;
2. 大庆油田总医院病理科, 黑龙江 大庆 163001;
3. 贵州医科大学第三附属医院实验中心, 贵州 都匀 558000
摘要目的 研究瞬时感受器电位香草酸受体3(TRPV3)通道蛋白对胶质瘤U251细胞系增殖和侵袭的影响及分子机制。方法 应用siRNA技术敲除U251细胞中TRPV3的表达,MTT方法检测细胞的增殖能力,Western blotting检测增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达。结果 敲除TRPV3表达后U251细胞增殖和侵袭能力下降,磷酸化的CaMKⅡ和cyclin D1的表达也受到抑制。结论 TRPV3通道蛋白能够促进胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭能力。其机制是TRPV3通道开放,细胞外Ca2+内流,cyclin D1过表达促进细胞的增殖。
关键词瞬时感受器电位香草酸受体3    胶质瘤    增殖    侵袭    细胞周期蛋白D1    
Transient Receptor Potential Vanilloid 3 Promotes Proliferation and Invasion in Glioma U251 Cells
1. Department of Neurosurgery, The Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Duyun 558000, China;
2. Department of Pathology, General Hospital of Daqing Oil Field, Daqing 163001, China;
3. Department of Medical Experimental Center, The Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Duyun 558000, China
Abstract: Objective To study the effect of transient receptor potential vanilloid 3(TRPV3) channel protein on the proliferation and invasion in glioma U251 cell line and its molecular mechanism. Methods TRPV3 expression was knocked down using siRNA technology in glioma U251 cells. The MTT method was used for detection of cell proliferation. Western blotting was performed to detect the expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA), matrix metalloproteinase(MMP) -2 and MMP-9, calcium/calmodulin-dependent kinase Ⅱ (CaMKⅡ), and cyclin D1. Results Knockdown of TRPV3 expression inhibited U251 cell proliferation and invasion and the expression of phosphorylated CaMKⅡand cyclin D1. Conclusion TRPV3 channel protein can promote the proliferation and invasion of glioma U251 cells. The mechanism is overexpression of cyclin D1 via extracellular Ca2+ influx, induced by the opening of the TRPV3 channel.

神经胶质瘤是起源于神经外胚层的颅内常见肿瘤,占颅内肿瘤的50%以上,具有高发病率、高复发率、高病死率和低治愈率的特点。虽然临床上应用手术、化疗、放疗等综合治疗方法,但是中低分化星形细胞瘤和胶质母细胞瘤的治疗效果仍无明显改善,肿瘤多在术后7~10个月内复发[1]。因此,针对调控胶质瘤增殖、分化的表面分子以及信号通路等新治疗靶点的研究非常必要。瞬时感受器电位香草酸受体3(transient receptor potential vanilloid 3,TRPV3)是瞬时感受器电位通道蛋白的家族成员,被认为是一种钙离子通道蛋白,在皮肤、角化细胞、脑、脊髓、背根神经节等多种组织中都有表达,并通过接受细胞外信号发挥其生理功能,对机体产生影响[2-3]。在多种肿瘤中TRPV3都有表达,如结肠癌、肝癌、肺癌、膀胱癌等,并与肿瘤的发生发展密切相关[4]。但是,TRPV3通道蛋白在胶质瘤发展过程中的作用,仍未有相关研究和报道。本研究探讨了TRPV3通道蛋白对胶质瘤U251细胞系增殖和侵袭的影响及其分子机制。

1 料与方法 1.1 材料

U251细胞系购自中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库。培养基DMEM购自美国HyClone公司,胎牛血清购自四季青天杭生物科技有限公司。0.25%胰酶购自美国Gibco公司。MTT试剂盒购自美国Sigma公司。TRPV3抗体购自以色列Alomone公司。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent kinase Ⅱ,CaMKⅡ)、磷酸化-钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(phospho-calcium/calmodulin-dependent kinaseⅡ,p-CaMKⅡ)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。RIPA蛋白裂解液、BCA试剂盒、蛋白质免疫印迹检测试剂盒均购自碧云天公司。ECL发光试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。TRPV3 siRNA(20 nmol/L,正义:5’-ACCUGCCUGAUGAAAGCUUTT-3’,反义:5’-AAGCUUUCAUAGGCAGGUTT-3’)购自上海吉玛制药技术有限公司,X-tremeGENE siRNA转染试剂购自美国Roche公司。

1.2 U251细胞培养与转染

37 ℃、5%CO2环境下,在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养细胞。分为空白对照组(CON组)、阴性对照组(NC组)、TRPV3 siRNA干扰组(siTRPV3组)。细胞接种在6孔板中,培养至70%~80%融合后,按X-tremeGENE siRNA转染试剂说明书分别将TRPV3 siRNA和NC siRNA转染细胞,继续培养24 h后检测转染效率。

1.3 MTT法检测TRPV3对U251细胞系增殖的影响

各组细胞经0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液,计数后以2 000/孔接种到96孔板中,每孔总体积为100 μL,每组细胞设置6个复孔,共接种于5块培养板中。在培养箱中继续培养24、48、72、96 h。按时间吸除培养液,每孔加入20 μL无菌MTT溶液,继续在培养箱培养4 h,弃除孔内上清,每孔加入二甲基亚砜150 μL,震荡15 min。应用酶联免疫检测仪,在490 nm波长处测定各孔光密度(OD)值。取6个复孔平均值,计算细胞的增殖率。

1.4 Western blotting

收集不同处理组的U251细胞,利用RIPA裂解液提取总蛋白,BCA方法测定蛋白浓度,上样量为60 μg,进行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜后封闭2 h。滴加一抗工作液,4℃冰箱过夜,滴加二抗,室温下孵育2 h,洗膜后进行ECL显色,应用自动电泳凝胶成像分析仪采集结果。

1.5 统计学分析

应用SPSS 16.0统计软件。数据以x±s表示,采用t检验进行分析,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 TRPV3 siRNA转染后U251细胞中TRPV3和PCNA蛋白表达减少

在U251细胞中敲除TRPV3表达,Western blotting检测发现,与CON组和NC组比较,siTRPV3组TRPV3蛋白表达明显降低(P < 0.01),CON组和NC组比较无统计学差异;与CON组和NC组比较,siTRPV3组U251细胞中PCNA蛋白表达也减少(P < 0.05)。见图 1

A,TRPV3;B,PCNA.* P < 0.05 vs NC group;** P < 0.01 vs NC group;# P < 0.05 vs CON group;## P < 0.01 vs CON group. 图 1 各组U251细胞中TRPV3和PCNA蛋白的表达 Fig.1 TRPV3 and PCNA expression in U251 cells

2.2 敲除TRPV3表达后U251细胞增殖能力下降

MTT方法检测各组U251细胞的增殖能力,siTRPV3组与CON组和NC组比较,不同时间点U251细胞增殖能力均下降(24和48 h,P < 0.05;72和96 h,P < 0.01),CON组和NC组比较无统计学差异,见图 2

* P < 0.05 vs NC group;** P < 0.01 vs NC group;# P < 0.05 vs CON group;## P < 0.01 vs CON group. 图 2 MTT检测细胞增殖的变化 Fig.2 Cell growth analyzed by MTT in U251 cells

2.3 敲除TRPV3表达后U251细胞侵袭能力下降

采用Western blotting检测不同处理后U251细胞中侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达,与CON组和NC组比较,siTRPV3组MMP-2(P < 0.01)和MMP-9(P < 0.05)蛋白的表达明显降低,CON组和NC组比较无统计学差异。见图 3

* P < 0.05 vs NC group;** P < 0.01 vs NC group;# P < 0.05 vs CON group;## P < 0.01 vs CON group. 图 3 各组U251细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达 Fig.3 MMP-2 and MMP-9 expression in U251 cells

2.4 敲除TRPV3表达影响CaMKⅡ磷酸化和cyclin D1的表达

TRPV3是一种钙离子通透性蛋白,Western blotting检测结果显示,siTRPV3组U251细胞中p-CaMKⅡ表达明显少于CON组和NC组(P < 0.01),见图 4A;同时,cyclin D1的表达也明显减少(P < 0.01),见图 4B;CON组和NC组比较无统计学差异。

A,p-CAMKⅡ;B,cyclin D1.** P < 0.01 vs NC group;## P < 0.01 vs CON group. 图 4 各组U251细胞中p-CAMKⅡ和cyclinD1蛋白的表达 Fig.4 p-CAMKⅡand cyclin D1 expression in U251 cells

3 讨论

细胞内钙离子(intracellular free Ca2+,[Ca2+]i)是细胞内重要的第二信使,在多种生理、病理过程发挥作用,如调控细胞分化、增殖、凋亡、坏死等。研究[5]已证实胶质瘤的[Ca2+]i浓度高于正常细胞,对肿瘤细胞内信号转导的紊乱起了非常重要的作用。

TRPV3通道对Ca2+与Na+离子选择是10: 1,研究结果表明,TRPV3可作为一种钙离子通道蛋白。其通道开放使[Ca2+]i浓度升高,引起膜去极化,动作电位形成,细胞内信号转导机制被激活,进而调控神经传递、细胞周期进程、细胞凋亡等多种细胞生理功能[6-9]。研究[10]发现,TRPV3能够促进口腔上皮细胞的增殖和伤口愈合。因为其电导较小,可以传递长时程的钙信号,而长时程的Ca2+内流影响细胞增殖等一些慢细胞的活动。在膀胱癌的研究中发现,TRPV3基因激活后可明显减慢膀胱癌细胞增殖,促进凋亡[11-12]。在非小细胞肺癌研究中发现,敲除TRPV3表达,肿瘤细胞增殖能力下降[4]。本研究结果显示,在胶质瘤U251细胞中干扰TRPV3表达后PCNA表达减少,肿瘤细胞的增殖能力明显下降;同时侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达也减少,提示TRPV3能促进胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭能力。

高浓度的Ca2+可通过激活磷脂酶C、蛋白激酶C、Ras/PI3K、ERK1/2等信号通路,通过多个环节参与细胞周期进程调控,影响肿瘤细胞的增殖和侵袭[13]。CaMKⅡ也受细胞内Ca2+浓度调节,可以绑定在Ca2+/CaM被激活而发生自动磷酸化,在结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤中CaMKⅡ都被激活,促进肿瘤细胞的增殖[14]。本研究结果显示,U251细胞系中敲除TRPV3,p-CaMKⅡ表达减少,提示TRPV3影响了U251细胞内Ca2+浓度,进而影响CaMKⅡ的激活。

目前研究发现细胞内钙离子在多个环节参与细胞周期调控,可影响细胞周期相关蛋白的表达,如cyclin D1,启动细胞周期进程。cyclin D1在许多癌组织中过表达,且与癌细胞的增殖有关,可以通过调控细胞周期G1期限制点而调节细胞增殖[15]。本研究结果发现,U251细胞系中敲除TRPV3,cyclin D1蛋白表达减少,提示TRPV3蛋白通过影响细胞内Ca2+浓度,调控细胞周期蛋白cyclin D1的表达,进而影响细胞周期进程。

综上所述,TRPV3通道蛋白能够促进胶质瘤U251细胞的增殖和侵袭能力。其机制可能是TRPV3通道开放,细胞外Ca2+内流,cyclin D1过表达促进细胞的增殖。说明TRPV3通道蛋白与肿瘤的发生发展密切相关,为肿瘤靶向治疗提供了新途径,但是在不同肿瘤组织中TRPV3发挥的作用与机制还需要进一步探讨和研究。

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