2018, Vol. 47文章信息
- 杨帆, 陈英剑, 吴艳花, 胡成进
- YANG Fan, CHEN Yingjian, WU Yanhua, HU Chengjin
- 人激肽释放酶相关肽10 ELISA方法建立及其临床应用
- Establishment of a Method for Detecting Kallikrein 10 in the Serum and Its Clinical Application
- 中国医科大学学报, 2018, 47(4): 299-304
- Journal of China Medical University, 2018, 47(4): 299-304
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文章历史
- 收稿日期：2017-06-16
- 网络出版时间：2018-04-09 11:15
引用本文 |
2. 济南军区总医院实验诊断科, 济南 250031
2. Department of Laboratory Medicine, General Hospital of Jinan Military Command Region, Jinan 250031, China
人激肽释放酶(kallikreins，KLKs)基因表达一组在调节正常生理功能中具有重要作用的丝氨酸蛋白酶，是近年来发现的一类对肿瘤诊断和预后颇具潜力的标志物家族。该家族共包括15个基因(KLK1~KLK15)，分别编码含230个氨基酸的人KLKs相关肽(KLK1~KLK15) [1]，越来越多的研究[2-5]证明其与肿瘤发生发展具有密切相关性。KLK10基因也称NSE1基因，免疫定位于细胞质，无组织特异性[6]，编码含276个氨基酸的丝氨酸蛋白酶—KLK10[7]，目前研究未发现其蛋白酶活性[8]。研究[9-12]表明KLK10 mRNA及相关肽的表达异常与乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤的发生发展密切相关[13-16]，其中CpG岛甲基化导致KLK10 mRNA的沉默是肿瘤发生发展的重要环节。国外研究[17]报道KLK10与乳腺癌浸润具有相关性，KLK10的表达缺失可以作为乳腺原位癌发展为浸润性导管癌的指征之一，且出现KLK10甲基化乳腺癌患者比未出现KLK10甲基化患者的预后差[18]，表明KLK10有潜力成为乳腺肿瘤预后的标志物。LUO等[19-20]还发现KLK10与乳腺癌患者三氧苯胺和曲妥珠单抗的个体化治疗具有相关性，可作为其耐药的预测标记物。本研究拟建立KLK10血清学检测方法，进而快速测定血清KLK10含量，为临床和后续研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 研究对象及分组收集济南军区总医院甲状腺乳腺外科2015年至2016年收治的女性乳腺癌患者血清标本80例，平均年龄(42±3.7)岁。参照TNM分期系统和乳腺癌分子分型新方法[18]，分为乳腺导管内癌、浸润性乳腺癌；其中浸润性乳腺癌又分为Luminal A型、Luminal B型、HER-2-rich型、三阴型。根据病理学淋巴结转移情况分为转移组和未转移组。同期收集济南军区总医院女性乳腺良性病患者血清标本50例，平均年龄(43±4.1)岁。乳腺癌患者及乳腺良性病标本均经术后病理学确诊，术前均未进行临床治疗。另收集济南军区总医院女性健康体检血清50例作为对照组，入选标准为既往无乳腺癌等乳腺相关疾病，体检未见其他恶性疾病。平均年龄(44±5.4)岁。3组年龄差异无统计学意义(P﹥0.05)，具有可比性。
研究对象均清晨空腹采血，采集静脉血(5 mL)，3 000 r /min离心5 min分离血清，置于-80 ℃冰箱保存。
1.2 材料 1.2.1 实验菌/细胞株与动物Rosetta (DE3)菌株购自TIANGEN公司；BALB/c小鼠均为SPF级，雌性，6~8周龄，购买于山东大学实验动物中心(许可证号：SCXK20150008)。新西兰大白兔，雄性，2.5~3 kg，购买于济南西岭角养殖繁育基地(许可证号：SCXK20150001)。
1.2.2 实验主要试剂弗氏佐剂购自Sigma-Aldrich公司；IMAC Ni-Charged Resin购自美国伯乐BIO-RAD公司；双色预染蛋白质Marker (MP203)，Bradford蛋白质定量试剂盒购自TIANGEN公司；Protein A IgG纯化试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；Glue B型活化辣根过氧化物酶购自泰天河生物技术有限公司。
1.2.3 实验仪器全自动酶标洗板机购自上海汇松科技有限公司；低温高速离心机购自德国Eppendorf公司；恒温金属浴购自博科生物有限公司；超声破碎机购自宁波新芝生物科技有限公司；680酶联免疫检测仪购自美国BIO-RAD公司。
1.3 方法 1.3.1 KLK10重组蛋白制备将含有KLK10 cDNA序列的pET28a载体导入E.coli Rosetta (DE3)中培养。加入1 mmol/L IPTG在28 ℃诱导8 h后收集菌体，利用超声破碎仪裂解菌体获得裂解上清，采用Ni-NTA亲和层析的方法纯化裂解上清，得到KLK10重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行鉴定，通过Bradford蛋白定量方法检测KLK10重组蛋白浓度。
1.3.2 KLK10单克隆/多克隆抗体制备采用杂交瘤技术诱生富含KLK10单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)的小鼠腹水，利用KLK10重组蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得抗血清[21]。蛋白A纯化柱纯化腹水及抗血清，获得KLK10单克隆/多克隆抗体(polyclonal antibody，pAb)。
1.3.3 KLK10 ELISA检测方法建立Clue B型活化辣根过氧化物酶标记KLK10多克隆抗体，7.5 μg/mL KLK10单抗100 μL 4 ℃包被过夜；次日洗涤，洗涤后扣干孔内残留液体；每孔加入含4%牛血清白蛋白(BSA) 200 μL，置37 ℃封闭2 h后洗涤；将浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 ng/mL的KLK10重组蛋白和血清样本分别加入包被微孔中，每孔100 μL，每例标本均设置1个复孔，37 ℃孵育1 h后洗涤；将酶标多抗按1:800的比例稀释，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min后洗涤，去除未结合的酶结合物；向各反应孔内加入底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB)各50 μL，37 ℃避光孵育10 min；每孔加入2 mol/L硫酸溶液50 μL终止反应；用酶标比色仪测定各孔在450 nm处的吸光度(A)值；以不同KLK10重组蛋白浓度和相应的A值绘制标准曲线，计算出血清标本中KLK10含量。
1.3.4 KLK10 ELISA检测方法评估(1)检测范围，检测下限和标准曲线检测最高值确定检测范围。(2)精密度，将2份不同血清样本同批连续测定8次，得到批内变异系数；将2份不同血清样本按照1次/d连续测定8 d，得到批间变异系数。(3)特异性，采用建立好的双抗体夹心ELISA检测方法对有可能的其他干扰因素或同源蛋白(BSA、KLK5、KLK6)进行检测，观察是否存在交叉反应。(4)重复性，选择标准曲线范围内的4个浓度(5、10、15、20 ng/mL)的KLK10重组蛋白，每个浓度反复测定6次，分析检测方法的重复性。(5)样品稳定性，将KLK10重组蛋白用PBS稀释至系列浓度，均分成3份，分别放置0、3和6 h后利用本方法检测，根据检测结果分别绘制标准曲线并进行比较。(6)样品回收率测定，将重组蛋白分别用PBS稀释至2、10、50、100 ng/mL，用本方法对样本进行检测，根据检测得到的OD450值和标准曲线计算出每个浓度的测定值，计算样品回收率。
1.3.5 血清CEA和CA153检测方法使用罗氏combs 6001全自动电化学发光分析检测仪检测乳腺癌组血清中CEA和CA153的含量。临界参考值分别为CEA 5 ng/mL和CA153 25 U/mL [22]。
1.4 统计学分析应用SPSS 21.0对数据进行统计学分析，所有指标均进行正态性检验，定量资料用x±s表示，差异性检验采用两独立样本t检验，定性资料的差异性检验采用列联表(R×C表)的χ2检验，当列联表中超过20%的理论频数 < 5时采用Fisher确切概率法或似然比。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 KLK10原核诱导表达及鉴定根据SDS-PAGE结果，KLK10原核诱导的最佳诱导条件为1 mmol/L IPTG在28 ℃条件下诱导8 h。通过SDS-PAGE和Western blotting对KLK10重组蛋白进行鉴定(图 1)，可见32×103处明显条带，与KLK10重组蛋白分子量一致。KLK10纯化后重组蛋白浓度约为2 mg/mL。
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| 1, marker; 2, purified protein (1 μg); 3, BSA 0.5 μg; 4, BSA 1 μg; 5, BSA 2 μg. A, the SDS-PAGE of KLK10 recombinant protein; B, detection of anti -His-tag antibody of 0.5 g purified protein. 图 1 KLK10重组蛋白SDS-PAGE和Western blotting鉴定 Fig.1 SDS-PAGE and Western blotting of KLK10 recombinant protein |
2.2 pAb和mAb效价与浓度测定
采用间接酶联免疫吸附法测定pAb和mAb的效价，分别以磷酸盐缓冲液、免疫前静脉血清作为对照，测定450 nm处的吸光值，判定P/N≥2.1时的最大稀释度为抗体效价。结果显示，pAb和mAb的效价分别为1:107，1:106。通过Bradford蛋白定量方法检测纯化后pAb和mAb的浓度，分别为1.2、10.1 mg/mL。
2.3 确定最佳工作条件单克隆抗体和酶标多抗的最佳工作条件：单抗包被浓度为7.5 μg/mL，酶标多抗工作浓度为1:800。
2.4 绘制KLK10蛋白浓度标准曲线测定KLK10蛋白浓度(100、50、25、12.5、6.25、3.125、0 ng/mL)与其相应的A值绘制标准曲线，见图 2。直线回归方程：y=0.008 3x+0.198 3 (R2 > 0.99)，线性范围为0.2~200 ng/mL。
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| 图 2 酶联免疫法标准曲线 Fig.2 Standard curve of ELISA |
2.5 方法学评价 2.5.1 检测下限
最低检测线是测量出的最低标准品检测浓度±2SD得到的浓度，确定为本方法的检测下限为0.245 ng/mL。
2.5.2 精密度分别检测批内及批间样本来判断该方法的精密度，批内平均变异系数为4%~9%，批间平均变异系数为5%~8%。
2.5.3 特异性检测发现本检测方法对于KLK10高度同源的KLK5和KLK6的检测结果随着浓度的增高存在波动，但2者的波动并不存在固定的趋势，且反应程度与浓度无关，因此该检测方法与两者无交叉反应。
2.5.4 重复性6次测定4个浓度(5、10、15、20 ng/mL)的KLK10重组蛋白相对标准差，分别为3.24%、4.55%、4.78%、5.69%，证明重复性良好。
2.5.5 样品回收率检测不同浓度的KLK10重组蛋白，将得出的OD450值代入标准曲线，计算出相应的浓度，计算回收率并进行对比，结果显示样品回收率较好。见表 1。
| PC(ng/mL) | DC(ng/mL) | Recovery (%) | RSD (%) |
| 2 | 1.73±0.57 | 92 | 28 |
| 10 | 10.25±1.21 | 101 | 21 |
| 50 | 46.82±5.64 | 89 | 25 |
| 100 | 102.35±15.64 | 98 | 23 |
| PC，protein concentration；DC：determination concentration；RSD，relative standard deviation. | |||
2.6 临床应用 2.6.1 定量检测样本血清中KLK10含量
乳腺癌患者、乳腺良性病患者、健康对照组血清中KLK10的检测结果分别为(0.88±0.45)、(1.35±0.56)、(1.57±0.88) ng/mL，乳腺癌患者血清KLK10含量明显低于乳腺良性患者和健康对照组(P= 0.025)，乳腺良性患者和健康对照组比较无统计学差异(P= 0.134)。根据ROC曲线得到cut-off值为1.48 ng/mL，将KLK10含量低于cut-off值判定为阳性。80例乳腺癌患者中有58例低于阈值，KLK10检测灵敏性为72.5%，特异性为88%，Youden指数(正确诊断指数)为0.605。
2.6.2 血清KLK10含量与乳腺癌临床指标相关分析结果显示，KLK10含量与临床分期相关(P < 0.05)，而与病理学分型以及转移情况不相关(P > 0.05)，见表 2。
| Index | n | KLK10 (﹢) | KLK10 (-) | P | |||
| n | PP(%) | n | PP(%) | ||||
| Stage | 0.013 | ||||||
| Ⅰ | 26 | 9 | 34.6 | 17 | 65.4 | ||
| Ⅱ | 44 | 35 | 79.5 | 9 | 20.5 | ||
| Ⅲ | 10 | 10 | 100.0 | 0 | 0.0 | ||
| Molecular type | 0.276 | ||||||
| Luminal A | 18 | 11 | 61.1 | 7 | 38.9 | ||
| Luminal B | 32 | 22 | 68.8 | 10 | 31.2 | ||
| HER2-rich (+) | 9 | 6 | 66.7 | 3 | 33.3 | ||
| Triple negative | 5 | 3 | 60.0 | 2 | 40.0 | ||
| Metastasis | 0.082 | ||||||
| Transfer | 18 | 15 | 83.3 | 3 | 16.7 | ||
| Non-transfer | 62 | 46 | 74.2 | 16 | 25.8 | ||
| KLK10 cut-off=1.48 μg/L；PP，percent point. | |||||||
2.6.3 KLK10与乳腺癌常用血清学标志物的比较
结果显示，KLK10对乳腺癌的诊断灵敏性、特异性、准确率以及Youden指数均较高(表 3)，证明KLK10具有诊断乳腺癌的潜力。
| Indicator | KLK10 | CEA | CA153 |
| Sensitivity | 72.5 | 25.0 | 40.0 |
| Specificity | 88.0 | 96.0 | 98.0 |
| Accuracy | 78.4 | 52.3 | 62.3 |
| Youden index | 60.5 | 21.0 | 38.0 |
2.6.4 KLK10、CEA、CA153联合诊断的评价
结果显示，不同形式的组合均可提高诊断灵敏性和准确率，联合检测效果更好(表 4)。
| Item | Sensitivity | Specificity | Accuracy | Youden index |
| KLK10+CEA | 61.3 | 92.0 | 73.1 | 53.3 |
| KLK10+CA153 | 78.8 | 94.0 | 84.6 | 72.8 |
| CEA+CA153 | 43.8 | 98.0 | 64.6 | 41.8 |
| KLK10+CEA+CA153 | 81.3 | 96.0 | 86.9 | 77.3 |
3 讨论
乳腺癌是西方女性最常见的恶性肿瘤，我国发病率和病死率也呈现逐年增高的趋势[23]。目前国内乳腺癌诊断还是依靠影像学检查和病理诊断，两者费用较高，且对患者具有一定的危害。血清学检测是临床早期筛查、治疗、预后判断的常用方法，具有简便、成本低，可长期、动态监测疾病发展等优势。本研究建立了KLK10双抗体夹心ELISA检测试剂盒，并进行了方法学评估，证明该方法灵敏性和特异性较高，精密度、重复性和稳定性较好，可用于KLK10的定量分析。采用本方法检测血清KLK10含量发现，乳腺癌患者血清中KLK10的含量低于乳腺良性病患者和健康对照组(P < 0.05)，证明KLK10在乳腺癌患者血清中表达降低；浸润性导管癌Ⅰ期和Ⅱ期患者血清中KLK10含量明显高于Ⅲ期患者(P < 0.05)，证明KLK10的表达与肿瘤的浸润性有关，随着浸润的深入，表达逐渐受到抑制直至缺失，与此前KLK10 mRNA的研究结果一致[24]。经过分析发现血清KLK10含量与乳腺癌的临床分子分型和转移情况之间没有显著性差异(P > 0.05)，证明血清KLK10的表达与雌激素、孕激素以及HER2+的表达不具有显著相关性(P > 0.05)，由于本研究纳入的三阴型乳腺癌标本数量有限，因此不能完全确证KLK10不受体内激素调节，仍需加大样本量进行进一步确证。
目前临床上常用的乳腺癌血清标志物为CEA和CA153，研究[25-26]表明CEA和CA153在乳腺癌诊断中具有一定的临床价值，但单独应用于临床诊断时仍具有一定局限性。本研究发现KLK10对乳腺癌的诊断灵敏性、准确率和Youden指数均高于CEA和CA153，证明KLK10有潜力成为乳腺癌的新型血清标志物。联合诊断结果显示，不同形式的组合均可提高诊断灵敏性，且CA153和KLK10联合检测可提高灵敏性。而CEA、CA153和KLK10 3者联合检测的灵敏性、准确率和Youden指数升高幅度并不显著，临床意义不大。
综上所述，KLK10是一种非常有潜力的标志物，对临床乳腺癌的早期诊断和预后判断具有重要意义。
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